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1、PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用2006年第4期（总第105期）广西热带农业45PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用宋卡魏王星云张荣意（华南热带农业大学环植学院，海南億州571737）摘要:PCR及其相关技术用于体外扩增DNA,RNA具有灵敏，快速，简便等优点，已经广泛应用丁•植物病原细菌的检测.本文综述了real一timefluoreseentPCR,REP一PCR,Irlq〜hmo—RCR,RAID—PCR,Nested—PCR等技术的原理及其在植物病原细菌检测和鉴定中的应用现状.关键词:PCR植物病原细菌检测鉴定聚合酶链反应
2、（polymerasechainreaction,PCR）是1983年由美国PE_Cetus公司的KaryMullis等n发明,1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统.PCR及其相关技术具有快速，灵敏，操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学，医学，微生物学等领域.且在这些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景•传统的PCR技术在植物病原细菌学的检测应用已经非常广泛12,3,4,5,61但是由于植物病害的多样性以及植物病原细菌的复杂性，使传统的PCR技术较难满足需要，由此专家学者们研制出了许多以PCR技术为基础的相关技术，如Real一timefluo
3、rescentPCR,rep一PCR,〜nnluno—PCRJTS—PCR等•这些方法使植物病原细菌的检测更加方便，快捷，灵敏，本文简要介绍一些PER相关技术的原理及其在植物病原细菌检测屮的应用概况.1Real一timefluorescentPCR其原理是在常规PCR的基础上，增加1条双荧光标记的核酸杂交探针，即Taqman探针;随着实吋PCR反应体系的进行，每进行一次DNA扩增，就有一个探针被切断，同时荧光信号值被记录下来,且与扩增产物的量产生一对一的对应关系，产物的量越大，荧光信号就会越强，也即反应起始的模板数越高,就越容易达到个荧光信号阈值，循环次
4、数（Ct值）和反应体系的底物浓度就会形成一个严格的对应关系,根据标准曲线和Ct值，即可以准确地确定扩增基因的浓度….实时荧光PCR在全封闭状态下实现PCR扩增.荧光探针杂交，信号检测不需电泳和EB染色,可以有效地降低污染和假阳性的产牛，具有操作简单,省时省力，精确性高，特界性强，安全快速，准确灵敏等优点.漆艳香等硝将玉米细菌性枯萎病菌16S1DNA基因克隆测序，根据该细菌与其它待测细菌菌株16srDNA序列差异,设计岀对玉米细菌枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针•进行实时荧光PCR检测，结果显示只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，且灵敏度较高，反应体系中只要
5、有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到.根据此技术原理与路线,漆艳香等又分别构建了苜蓿萎驚病菌,菜豆细菌性萎驚病菌B。］和香蕉细菌性枯萎病菌…的实时荧光PCR检测体系.朱建裕等n根据梨火疫细菌中独特含有质粒pEA29,设计了1对引物和3条探针，建立了梨火疫细菌实时荧光PCR的检测方法.2REP—PCR原核与真核牛物中普遍存在着散布的重复DNA序列，这些序列由于发挥着生物体基本的功能作用，因此在进化屮呈高度保守的状^.REP(repetitiveeX・tragenicpalindromic)^nERIC(enterobactefialrepetitivei
6、n・tergenicC012Sensus))H于这样的序列.研究发现,REP,ERIC等序列在微生物中广泛存在，随机分布且在进化中呈高度保守状态.因此，研究人员以REP,ERIC等序列为引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型，从而形成了被测菌基因组特异的指纹图谱，该技术称rep-PCRDNA指纹技术.该技术方法简单，快速，敏感和分辨率高,现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定广西热带农业2006年第4期(总第105期)细菌间的亲缘关系.S.V.Tsygankova等”对Xanthomonas,pseudumon
7、as,Erw/n/a等病原菌进行鉴定时,发现所有被测的.campestr/s均能通过引物KRPN2扩增出一段约600bp的片段，接着用引物SCAR进行扩增，在所有的.〜tr/s上出现一条特异性条带，而在其他的被测菌株上不能出现他利用这特点，进行rep-PCR,结果能有效，迅速地对被测菌株进行鉴定.J.Louws等［14在对339个Xant~monas进行鉴定时,也成功地应用了rep一PCR技术获得理想结果.在日本,Ralstoniasolanacearum小种4和小种1广泛存在于西红柿，马铃薯等植物上,除非进行致病性测试，否则很难将两者区分,Mitsuo
8、Horita等人利用小种4中存在特异性序列(AKIF—AKIR)和(21F—21
