afp和pten在肝癌细胞中的表达及afp在全反式维甲酸诱导肝癌细胞凋亡中的作用

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1、AFP和PTEN在肝癌细胞中的表达及AFP在全反式维甲酸诱导肝癌细胞凋亡中的作用赵小丽高鹏刘俊华周凤蕊王佳乐李广明郑州市第六人民医院摘要：目的探讨AFP与PTEN在肝癌细胞中的表达情况及AFP对全反式维甲酸（ATRA）诱导肝癌细胞凋亡的影响。方法WesternBlot分析AFP和PTEN在肝癌细胞Bel7402和HLE中的表达情况,并用30umol/L和180umol/L的ATRA溶液处理细胞，观察其对AFP和PTEN表达的影响;应用免疫共沉淀技术分析PTEN和AFP的相互作用；构建AFP表达载体转染HLE细胞，观察AFP的表

2、达对ATRA抑制癌细胞生长的影响。结果PTEN在Bel7402和HLE细胞中均有表达，Bel7402细胞能表达AFP,HLE细胞则无AFP表达;经过180umol/LATRA处理24h之后，Bel7402细胞PTEN表达水平上升，AFP表达水平下降;AFP可与PTEN相结合；当ATRA浓度为30、60、90和180umol/L时，通过MTT法测得IILE细胞的A490分别为1.05、0.97、0.83、0.71、0.39;HLE成功表达AFP后，ATRA对癌细胞的抑制作用消失。结论AFP可抑制PTEN的活性;AFP可以通过与P

3、TEN结合的方式，抑制PTEN的磷酸酯酶活性;AFP可能通过抑制PTEN的表达方式，使肝癌细胞耐受ATRA诱导的凋亡。关键词：甲胎蛋白；PTEN;肝癌细胞;ATRA;诱导凋亡;作者简介：李广明，Ema订:sdbgll6@163.com收稿日期:2017-06-14Received：2017-06-14肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,I1CC）是一种常见的恶性肿瘤，其复发转移迅速，恶性程度高，患者预后情况差£11。HCC的转移和复发是多因素、多基因、多步骤、多阶段改变的过程及1，癌细胞对药物有一定的耐

4、受性，药物治疗效果有限，而手术治疗的患者术后仍有转移和复发的情况。抑癌基因靶向治疗是肝癌治疗的研究策略之一，近几年已成为肝癌治疗的研究热点与前沿。第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酉旨酶基因（phosphataseandtensinhomologuedeletedonchromosometen,PTEN)具有蛋白磷酸酯酶和脂质磷酸酯酶双重活性，是目前己经发现的第一个在体内具有脂质磷酸酯酶活性的抑癌基因空1，在多种遗传性肿瘤易感综合征和恶性肿瘤中均有PTEN基因突变或缺失的发现，提示PTEN失活可能与肿瘤发生有关凶。甲胎蛋

5、口(alphafetalprotein,AFP)是一种糖蛋白，可以使免疫细胞生长抑制、诱导凋亡，肝癌细胞AFP的阳性率为70%~90%,还有20%~30%为阴性，对癌症的诊断具有一定价值。全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)是维牛素A的衍牛物，近年来的基础研究和临床有报道将ATRA用于治疗急性白血病。本研究探讨了AFP与PTEN的相互作用及对ATRA抑制肝癌细胞活性的影响资料和方法一、材料与试剂人肝癌HLE和Bel7402细胞由我院检验科提供;小鼠抗人AFP单克隆抗体;兔抗人PTEN多克隆抗体由

6、美国LabVisioncorporation提供;FTTC-conjugated羊抗兔及TRITC-conjugatcd羊抗小鼠二抗购自美国JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc公司;ATRA由美国Sigma公司提供;pcDNA3.1载体由中国广州泰盛生物技术有限公司生产。二、试验方法(一)细胞培养将屮老年肝癌BC17402细胞接种于浓度为10%胎牛血清屮培养，IILE细胞则接种T*DMEM培养液中。当细胞长到铺满瓶壁约80%时，用0.25%的胰蛋白酶将细胞消化和传代，使用时用10%胎牛血清或

7、DMEM培养基将细胞稀释至一定倍数，便于后续操作。(―)WesternBlot分析细胞中相关基因的表达将IILE和BC17402细胞分别接种于培养瓶中，浓度为1.0X10个/mL,每瓶6mL,采用不含血清的培养基培养24h,后换成含10%胎牛血清的培养液培养12h,此为实验组。对照组另外加入30Mmol/L和180Mmol/L的ATRA溶液处理18h,其他条件与实验组相同。培养结束后收集并裂解细胞，提取总蛋白质，进行电泳、转膜、封闭和杂交等操作，用荧光仪拍摄蛋白质的条带，检测细胞AFP和PTE7蛋口的表达。(三)免疫共沉淀法分

8、析AFP与PTEN结合情况收集培养的Bel7402细胞，将细胞裂解后收集总蛋白，取少量蛋白作为后续对照。用proteinA琼脂糖珠分别吸附抗AFP单克隆抗体、抗PTEN多克隆抗体，4°C下孵育过夜，然后加入Bel7402细胞内提取的蛋白进行免疫共沉淀，得到吸附于琼脂糖珠的抗原