prdx5基因启动子的荧光素酶报告质粒的构建

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1、PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒的构建摘要：目的构建含PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒。方法①通过生物信息学方法，查询PRDX5基因启动子核酸序列；②使用PCR扩增人PRDX5基因启动子片段，将启动子插入到pGL3-Basic载体中，构建含PRDX5基因启动子片段的荧光素酶报告质粒；③双酶切及测序确定PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒扩增正确。结果PCR扩增的PRDX5启动子片段插入到载体中，经测序证实正确。结论成功构建含PRDX5启动子的荧光素酶报告质粒。关键词：PRDX5；启动子；荧光素酶报告基因ConstructionofLuciferaseRe

2、porterPlasmidPRDX5GenePromoterHULe-lin(SchoolofMedicine,TheAnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan232001,Anhui,China)Abstract：ObjectiveToconstructapGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidandtovertifyingitsluciferaseactivity.Methods@searchthenucleicacidsequenceofthepromoterPRDX5bybioinformat

3、icsanalysis.©MethodsofPCRwasperformedtoamplifythepromoterPRDX5.thepromoterPRDX5wasinsertedintopGL3-BasiccloningvectortoconstructluciferasereporterplasmidwiththepromoterPRDX5•③pGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwasverifiedbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ResultspGL3-PRDX5-promoter-L

4、ucplasmidwasidentifiedtobecorrectbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ConclusionApGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwassuccessfullyconstructed・Keywords:PRDX5;Promoter;Luciferasereporterplasmid;ReactiveoxygenspeciesPRDX5是Peroxiwdoxins(PRDXs)过氧化物酶家族蛋白的一种，研究显示在它广泛表达于哺乳动物的各种细胞，定位于细胞质、过氧化物酶

5、体和线粒体中，但在许多细胞中PRDX5主要定位于线粒体，它与组织过氧化物、过氧化亚硝基阴离子有高的亲和力[l]oMasakishiota[2]等人发现在外源过氧化氢处理或组织缺氧情况下人类前列腺癌PC3细胞PRDX5表达增高。研究还显示人类定位于线粒体的PRDX5能保护线粒体DNA免受过氧化氢的损伤。并且PRDX5能够抑制p53诱导的活性氧簇的产生和细胞凋亡［3］。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种、质粒和细胞系大肠杆菌tans-5a购自Trans-Gene（全式金）公司；载体质粒pGL3-Basic,由本室保存。1.1.2DNA重组所用工具酶及试剂BgllLM

6、lul等限制性内切酶，TaqDNAPolymerase,T4DNALigase购自NewEnglandLab和Promega公司。大提质粒试剂盒购自威格拉斯仪器有限公司。其它常规试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2方法1.2.1用PCR和酶切的方法得到目的片段利用DNA提取试剂盒在U2OS细胞中提取全基因组细胞作为模板，根据已知PRDX5cDNA序列，由生物信息学方法自UCSC数据库分析其可能的转录起始位点，选择TSS上游约1200bp下游约200bp范围作为其可能的启动子序列进行引物设计。预计扩增片段长度为1400bpo我们使用软件DNAMAN分析其上可能存在的限制

7、性内切酶位点，结合载体质粒pGL3-Basic上的限制性内切酶位点，选择分别在上、下游引物末端,添加BgllLMlul限制性内切酶位点序列。见表1122目的片段与相应载体的连接将扩增好的目的片段和PGL3-basic-Luc进行同样的双酶切鉴定，回收酶切产物，并进行质粒连接反应。在10M的反应体系中加入载体、插入片段、T4DNAligase、T4DNAligasebuffero载体与插入片段的摩尔数之比控制在1：3,且二者的总量控制在300ng〜500ng之间，置于4°C冰箱连接16ho目的片段和PGL3-basic-Luc通过BgllLMlul酶切