酶工程实验 讲义

《酶工程实验 讲义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、《酶工程实验》讲义——生物学实验教学中心实验二大肠杆菌菌体总蛋白的超声破碎抽提与蛋白质的凝胶过滤纯化[实验原理]利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速

2、度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的[仪器、试剂和材料]1、大肠杆菌2、细菌蛋白抽提液（100mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)3、恒温摇床4、小型高速离心机5、超声波组织细胞破碎仪6、玻璃试管，三角瓶7、1.5mL和5mL塑料离心管8、“枪”，枪头[实验操作]1、大肠杆菌的培养：从过夜培养的大肠杆菌LB琼脂平板上挑取2-3个菌落，接

3、种5mLLB的玻璃试管中，放恒温摇床中，37℃培养过夜。2、超声破碎抽提：将培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，pH8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作

4、2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。4次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在显微镜下观察菌体的破碎情况。如果在显微镜下仍能看到菌体，则需进一步破碎。菌体完全破碎后，8000转/分离心5分钟弃细胞碎片，上清转移至1.5ml离心管，即得蛋白12《酶工程实验》讲义——生物学实验教学中心粗提液，备凝胶层析用，或冷冻于-20℃。3.凝胶层析实验操作步骤：3.1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需

5、时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。表1凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml）G25G50G100G2000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014

6、035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.610060530100013025050110307017353.2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中

7、心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。12《酶工程实验》讲义——生物学实验教学中心3.3.加

8、样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用280nm波长测定吸光度，对一根2cm×60cm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过