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1、实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。实验原理H2O2被过氧化氢酶分解岀出0和02，未分解的h2o2用kmno4在酸性环境屮滴定，根据反应前后h2o2的浓度差可求出反应速度。EH2O2>2H2O+O22KMNO4+5H2O2>2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/v〜1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100〜150ml(X6)o2.吸管1.0ml(X2)、0.5ml(X2)、2.0ml(X2)、5ml(X2)、10.0ml(Xl)o3.温度计(0
2、〜100°C)o4.微量滴定管5ml(Xl)o5.容量瓶1000ml(Xl)o四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液(Ph7・0)取磷酸二氢钾0.68g,加0.lmol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml,即得。2、酶液：称取马铃薯5g,加上述缓冲液10ml,匀浆，过滤。3、0.02moVLKMnO4:称取KMnO4(AR)3.2g,加蒸徭水1000ml,煮沸15min,2d后过滤，棕色瓶保存。4、0.004mol/LKMnO4:准确称取恒重草酸钠0・2g,加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/
3、L的KMM)4滴定至微红色，水浴，加热至65°C,继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算岀KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中,加蒸憎水至刻度（约0.2mol/L）,用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml,加25%H2SO42.0ml,用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。6、25%H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定号试
4、剂0123450.05mol/LHpC^/ml01.001.251.672.55.00蒸憾水/ml9.58.508.257.837.04.50酶液/ml0.50.50.50.50.50.5先加好0.05mol/LH2O2及蒸懈水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶屮剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnCU体积。六、计算分别求出各瓶的底物浓度［S］和反应速度Vo［ShdVi/10ClVi——C2V：u=5式中［S］：底物
5、物质的量浓度（mol/L）；5：H2O2物质的量浓度（mol/L）；Vi：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；u：反.应速度（mmol/min）；c2：KMnCU物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/u对1/［S］作图求出Kim实验二酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。(请参考相关教材)三、试剂与仪器1、试剂与材料：(1)干酵母(2)右英砂(3)1
6、mol/L醋酸溶液(4)2mol/L氧氧化钠溶液(5)醋酸缓冲液(pH4.6)(6)5%蔗糖溶液(7)DNS(3,5■二硝基水杨酸)试剂2、仪器:电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。四、操作方法1、破碎细胞取2g干酵母于研钵中，加入2g石英砂，加30ml去离子水，研磨15min,放入冰箱冷冻室(-20°C)冰冻约20min(研磨液面上刚出现冰结为宜)。取出冷冻酵母，再研磨5min后，在5000r/min条件下离心12min,小心取岀上清液(组分一)并量岀体积分别取0.5ml±清液到试管A、B屮，余
7、者倒入三角瓶。2、纯化把三角瓶中的上清液用1mol/L醋酸溶液调pll5.0（试纸）。然后迅速放入到55°C的水浴中，保温30mino之后在冰浴中迅速冷却。在5000r/min条件下离心12mino取出上清液（组分二）并量出体积也，分别取0.5ml±清液到试管C、D屮。3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物:试管编号①酶液②氢氧化钠溶液③醋酸缓冲液④蔗糖溶液A（对照管）0.5ml1ml1ml1mlB0.5ml—2ml1mlC（对照管）0.5ml1ml1ml1mlD0.5ml—2ml1ml试管屮反应物在55°C水浴屮反应5min（秒表计
8、时）后，B、D管立即各加••入1ml氢氧化钠溶液（2mol/L）终止反应，A、C管屮各加入1ml蒸饰水。4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物:试管编号反应液DNS试剂10.5mlA0.
