酶工程实验指导

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1、广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月26编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修“酶工程与蛋白质工程”。本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，

2、具体如下：内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1，5产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备II、酶制剂的分离纯化及鉴定分析2鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离3纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析4纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析5木瓜蛋白酶制剂的制备III、酶制剂的体外改造6壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶*实验8中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。IV、酶制剂的应用7酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备8消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定V酶基因的重组表达9邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达VI实验总结及演示等实验

3、总结等。为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。编者2006年11月26实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便

4、形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。图1产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。2、试剂：RBV-Starch（Sigma）,NaNO3,K2HPO4,MgSO4,KCl,2mol/LNaOH无菌水和琼脂粉等。3、器皿250mL三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200µL移液枪、200µL枪头若干、牙签若干、指形管若干、10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、

5、取样器和塑料直尺等。4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。四、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20min，取出备用。262、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2%,w/v），NaNO3(0.2%,w/v),K2HPO4(0.2%,w/v),MgSO4·7H2O（0.1%,w/v）,KCl(0.1%,w/v),琼脂（2%,w/v）,调PH至6.0左右。在三角瓶中，121℃灭菌20min，将灭菌后的培养基

6、倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀，影响菌落的观察。）3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。4、富集称取5.0g混合土样和0.5g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。5、菌种的初筛称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌

7、水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。用移液枪分别吸取稀释100和1000倍的样品液50µL，加入至已凝固的培养基表面，用涂抹棒涂布均匀。将涂过样的培养皿倒置放置，于30℃培养箱里培养，观察菌落透明圈的出现情况。（一般30h后即可出现一些透明圈）。6、菌株的纯

8、化于超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成）用接种环挑取长势良好且透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分离能形成透明圈的单菌落。并在斜面培养基中保存。图2平板划线分离法示意图26五、结果处理与分析1、菌落产生透明水解圈的观察用直尺分别于不同方