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1、实验1、大蒜细胞SOD的提取和分离一、原理超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离了(O2・)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)3、氯仿■乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮：用丽需预冷至4-10°C5、0.05mol/L碳酸
2、盐缓冲液(pH10.2)6、O.lmol/LEDTA溶液7、2mmol/L肾上腺素溶液三、步骤1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8),继续研磨20min,使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5OOOrpm下离心15min,取上清液。3、除朵蛋口：上清液加入0.25体积的氯仿■乙醇混合液搅拌15min,5000rpm离心15min,得到的上清液为粗酶液。4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷
3、丙酮，搅拌15min,500()rpm离心15min,得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)中，于55-60°C热处理15min,得到SOD酶液。5、SOD活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各口的SOD活力。试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5蒸憾水0.50.5-样品液--0.5混合均匀,在30°C水浴中预热5min肾上腺素溶液-0.50.5加入肾上腺素后，继续保温2min,然后立即在480nm处测定光密度
4、。对照管和样品管的光密度值分别为A和Bo在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力（单位）=2（A-B）N/A式屮N——样詁稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。6、根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。实验2、酿酒酵母细胞固定化一、目的要求了解固定化酶及微生物细胞固定化的原理及其优缺点。掌握制备固定化细胞屮最基本、最常用的方法。学会用固定化酿酒酵母进行酒精发酵及酒精的测定方法。二、基本原理固定化酶和固定微生物细胞的原理是
5、将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相状态作用于底物，貝有离了交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1.吸附法；2.包埋法；3.共价交联法三、实验材料（一）菌种酿酒酵母。（-）培养基1•酒精发酵培养基YG分装200ml培养
6、基于300ml锥形瓶中,共4瓶,经100Pa灭菌备用。（三）主要药品海藻酸钠、琼脂、K-角叉胶、葡萄糖、蛋白质、酵母膏、明胶、戌二醛等。四、实验内容（一）酵母种子培养液的制备挑取新鲜斜而菌种一环，接入装冇30mlYPD培养基的锥形瓶屮，30°C振荡培养，共接4瓶，培养至对数期。（二）细胞的固定化：共价交联法吸取10ml培养到对数期的酵母菌悬液加入加25ml2%的明胶液中，混合均匀，倒入15cm的无菌平川1•中，在0〜5°C冻结后，切成3x3x3mm3小块，再浸入1.5%戊二醛中，室温下交联3h,将
7、颗粒转入300ml锥形瓶中，用无菌去离了水洗涤三次，加入YG培养基，置30°C培养72h后测定酒精含量。（三）结果观察1.固定化细胞的回收与活菌计数（1）取培养72h的固定化细胞，如含酵母的K・角叉凝胶包埋珠2粒，放入5ml无菌生理盐水中。培养前的凝胶珠同样处理。（2）37°C轻振15min,使胶珠溶解。（3）适当稀释后涂布于YPD琼脂平板进行活菌计数，观察酵母菌在包埋块中的増殖情况。2•酒精发酵液的蒸纟留及酒精度的测定（1）由于木次实验发酵液中所含酒精度较低，因此可用明火直接加热蒸係（图12-2
8、-2）o（2）取100ml发酵液，倒入500ml圆底烧瓶中,力□100ml蒸镭水蒸镭，沸腾后改用小火。当开始流出液体时，用100ml容量瓶准确接收镉出液l（）（）ml。倒入100ml量筒中，用酒精比重计测量其酒精度。剩余的发酵液全部倒出后弃去，将固定化细胞用无菌去离了水洗3次，加入YG培养基继续培养72h,测酒精含量，可反复使用数十次。E12-2-2固定化细胞酒精发酵液蒸憎装置1・发酵液装于烧瓶内：2・冷凝管；？・酒精收集器五、实验报告内容（-）将酿酒酵母细胞固定化经发酵培养后的结
