酶工程实验(2010)

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1、实验一植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：植物叶片2.仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。3.试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。反应液（100ml0.1m

2、ol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml愈创木酚、1ml30﹪H2O2，充分摇匀）。四、实验步骤1.酶液提取称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000r/min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。2.酶活性测定吸取反应液3ml于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A

3、470）。五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△A470×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）=———————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)原理】临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活力单位.试剂和器材】1,0.9%氯化钠2,0.1%淀粉3,碘化钾—碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使用前稀释10倍)4,移液管5,试管6

4、,恒温水浴锅操作】1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升.2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合(若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,然后任其流出.反复三次,使全管混匀.从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管……依次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,1/4,1/8……1/512毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作为对照管.3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37℃,并记录时间.注意保持水浴的温度

5、.4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.计算】选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫升.即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活力单位.实验三超氧物歧化酶活性的测定超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21

6、]。(一)原理超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。(二)材料、仪器设备及试剂1.材料：新鲜苎麻叶片2.仪器设备：(1)研钵(预冷)；(2)TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12000r/m

7、in,湖南星科科学仪器有限公司)；(3)PUS-2018型半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)；(4)移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml各数支）；(5)日光灯（反应试管处照度为4000Lx）；(6)试管数支；(7)洗耳球。3.试剂：　(1)0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）:A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移到250ml容量瓶中，定容。B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml容量瓶中