酶工程实验(2015.3)

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1、实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。3.温度计（0～100℃）。4.微量滴定管5ml（×1）。5.容量瓶1000ml（×1）。四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二

2、氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml,即得。2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。3、0.02mol/LKMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。4、0.004mol/LKMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml加

3、入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25%H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。6、25%H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/LH2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml09.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/LH2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依

4、次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。六、计算分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。[S]=c1V1/10式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；υ：反应速度（mmol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/υ对1/[S]作图求出Km。实验二酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促

5、反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内40

6、5nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸

7、酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的