冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究-外科学（烧伤）专业毕业论文

《冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究-外科学（烧伤）专业毕业论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

一、冻存活性微粒羊膜修复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面47二、冻存活性微粒羊膜移植后羊膜上皮细胞追踪50三、冻存活性微粒羊膜对创面炎症反应的调控51四、冻存活性微粒羊膜对创面新生血管化的调控54五、体外实验探讨冻存活性微粒羊膜条件培养基LMAM．CM对巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及表皮细胞的调控作用．．59讨{仑．68综述．76参考文献．81在读期间发表论文和参加科研工作情况．94致谢．96万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究摘要研究背景糖尿病足部溃疡是糖尿病的严重并发症之一，在糖尿病病程中大约有25％的病人会发生下肢溃疡。目前标准治疗方案主要包括清创、创面敷料覆盖保湿、创面感染控制、血管再造和减压治疗。但即使予以这些标准化治疗，糖尿病创面仍然愈合缓慢，大约7％。20％的病人最终需要截肢。现临床急需新的治疗手段加速糖尿病创面愈合，阻止足部溃疡最终导致的截肢。人羊膜来源于胎盘的最内层，主要包括单层羊膜上皮细胞层、厚基底膜层以及无血管基质层。早在20世纪初就有应用羊膜治疗创面的临床报道并取得了良好的效果。在过去的一百年中羊膜在创面愈合中的作用被许多文献所证实，主要通过加速上皮化、减轻炎症反应、抑制瘢痕形成和抗菌等作用促进创面愈合。近年来研究表明羊膜上皮细胞为多能干细胞，能向三个胚层细胞分化，且局部注射羊膜细胞浸提液及羊膜上皮细胞能加速急性创面的愈合。尽管此前众多研究表明羊膜在创面修复中的巨大潜能，但仍然存在许多缺点限制了人羊膜临床应用潜能的最大化。首先，目前的保存方法(冷冻干燥法、伽马射线灭菌法以及甘油保存等)无法完整保存羊膜细胞活性，导致羊膜上皮细胞活性完全丧失或仅保存极低活性。其次，羊膜非常薄，机械强度低，目前临床应用大张羊膜覆盖创面难以保证羊膜完全平整粘附到创面，羊膜很容易变干而与创面分离，仅能作为暂时的生物敷料短时间覆盖创面。另外，羊膜上皮细胞在慢性创面中的治疗作用及机制研究，以前未见报道。在本课题中，我们临床获取胎盘废弃新鲜羊膜并采用自制微粒皮切割机将其加工为300—600微米大小的微粒化羊膜。在应用商品化的无血清干细胞冻存液冻存微粒羊膜半年后，我们复苏羊膜并检测其形态结构、细胞活性及生物活性因子，随后移植复苏后的微粒羊膜修复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面，评估其治疗有效性。结果发现本研究所采用的冻存方法能良好保存羊膜的天然结构、细胞活性及生物活性因子。局部应用冻存微粒羊膜能明显促进糖尿病小鼠创面愈合，且移植后微粒羊膜中的羊膜上皮细胞能保持高移植潜能，在创面存活率高。随后我们进一步探究冻存活性微粒羊膜促进糖尿病创面愈合的机制，主要通过体内及体外实验探讨冻存活性微粒羊膜对糖尿病创面炎症的调控和新生血管化的影响，以及羊膜基质能否作为真皮替代物长期存在于创面促进真皮重构。研究方法1．采用自制微粒皮切割机将人新鲜羊膜制备为300．600微米大小微粒化羊膜，万方数据 第二军医大学博士学位论文随后应用无血清干细胞冻存液STEM．CELLBANKERⅢ冻存微粒羊膜半年，通过下面方法检测冻存效果。(1)H&E切片染色检测复苏后羊膜结构；(2)live／dead细胞活性试验检测复苏后羊膜上皮细胞活性；(3)扫描电镜观察复苏后羊膜上皮细胞膜结构；(4)收集冻存活性微粒羊膜条件培养基，采用人生长因子抗体芯片、人趋化因子抗体芯片及人炎症因子抗体芯片分别检测活性微粒羊膜条件培养基中生长因子、趋化因子及炎症因子的表达情况。2．将糖尿病小鼠分为三组：冻存活性微粒羊膜组、冻存去细胞微粒羊膜组和空白对照组。将冻存活性微粒羊膜移植于糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面并通过检测以下指标评估其修复效果。(1)定期拍照观察创面愈合大体形态并计算不同时间点创面愈合率；(2)H&E染色观察愈合创面的组织结构及羊膜在创面的降解情况；(3)H&E染色及免疫组织化学染色抗人线粒体抗体观察冻存活性微粒羊膜移植后羊膜上皮细胞转归情况，TUNEL染色检测人羊膜上皮细胞移植于创面后凋亡情况：(4)免疫组织化学染色抗F4／80抗体观察创面巨噬细胞数量，流式细胞术检测创面M1型及M2型巨噬细胞比例。ELISA检测创面促炎因子及创面愈合相关因子的表达情况；(5)流式细胞术检测冻存活性微粒羊膜移植后外周血内皮祖细胞数量，免疫组织化学染色抗CD34和CD31抗体分别检测创面造血祖细胞及新生血管数量。3．收集冻存活性微粒羊膜条件培养基，通过以下方法评估其对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞功能的影响。(1)CCK一8法检测冻存活性微粒羊膜条件培养基对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞增殖能力的影响；(2)Transwell小室测定冻存活性微粒羊膜条件培养基对原代鼠骨髓来源巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞迁移能力的影响：(3)小管形成实验检测冻存活性微粒羊膜条件培养基对人脐静脉内皮细胞成小管能力的影响；(4)IFN-y和TNF一0【刺激原代鼠骨髓来源巨噬细胞为Ml型巨噬细胞。通过显微镜观察冻存活性微粒羊膜条件培养基培养后巨噬细胞形态改变及PCR检测M1型、M2型巨噬细胞标志物基因表达水平的变化来评估冻存活性微粒羊膜条件培养基对巨噬细胞极化的作用。．2．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究实验结果1．冻存复苏后微粒羊膜和新鲜微粒羊膜中羊膜上皮细胞的活性分别为73．080／社2．95％和92．94％士2．27％。H&E染色结果显示复苏后单层羊膜上皮细胞紧贴于厚基底膜层，与新鲜微粒化羊膜结构类似。进一步扫描电镜结果显示复苏后羊膜上皮细胞膜结构保存完好，未见膜孔洞形成。人生长因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达AR，EGFR，CSF2，CSF3，HB-EGF,HGF,IGFBP一2，IGFBP．3，CSFlR，NT-3，PDGFR和TGF．B1。人趋化因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达GRO，IL．8，MCP一1和MIP．1b。人炎症因子抗体芯片结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基高表达IL．6，IL一8，MCP．1，MIP—lb，TGF—B1，TNF-p和TIMP一2。2．1．冻存活性微粒羊膜移植后7天，创面湿而红润，微粒羊膜存活良好。创面第21天冻存活性微粒羊膜组大部分创面完全愈合，平均创面愈合率为94．64％土2．67％，明显高于冻存去细胞微粒羊膜组(80．52％-4-3．85％，P<0．001)和空白对照组(68．40％4-5．37％P<0．001)。冻存活性微粒羊膜组及冻存去细胞微粒羊膜组中羊膜微粒充填于真皮基质，真皮厚度明显高于空白对照组，2个月左右大部分羊膜微粒发生降解。2．2．创面第5天，羊膜上皮细胞在创面存活良好，大部分紧密贴附于羊膜基质并显示出复层生长的趋势，仅非常少量羊膜上皮细胞发生迁移。创面第7天少量羊膜上皮细胞开始出现凋亡，第28天时创面未检测到人羊膜上皮细胞。2．3创面第5天冻存活性微粒羊膜组创面F4／80阳性巨噬细胞数目明显高于其他两组，但第10天时明显低于其他两组且M1型巨噬细胞比例显著低于其他两组、M2型巨噬细胞比例显著高于其他两组。创面第10天冻存活性微粒羊膜组创面促炎因子IL．1p、TNF一0【和IL一6表达显著减少，而促创面愈合因子TGF．B1、IGF-1和VEGF表达显著增高。2．4创面第5天冻存活性微粒羊膜组外周血内皮祖细胞数量明显高于其他两组，且创面CD34阳性细胞数量也显著增高。肉眼观显示创面第14天和21天冻存活性微粒羊膜组血管化明显高于其他两组，这一结果与免疫组化检测创面新生血管数量结果一致。3．IFN—Y+TNF．Ot诱导巨噬细胞伸出突起而冻存活性微粒羊膜条件培养基能诱导巨噬细胞伸长向M2型巨噬细胞形态转化，进一步PCR结果显示冻存活性微粒羊膜条件培养基能上调CD206基因表达而下调CCR7基因表达。冻存活性微粒羊膜条件培养基可促进巨噬细胞迁移而对其增殖无影响。同时，冻存活性微粒羊膜条．3．万方数据 第二军医大学博士学位论文件培养基促进人脐静脉内皮细胞、人原代成纤维细胞和表皮细胞迁移、增殖及增强人脐静脉内皮细胞体外成小管能力。实验结论1、人新鲜羊膜以微粒化形式并采用无血清冻存液STEM．CELLBANKERTM冻存能完好保存羊膜天然结构、羊膜上皮细胞活性及羊膜生物活性因子；2、局部应用冻存活性微粒羊膜能显著促进糖尿病小鼠创面愈合，且羊膜上皮细胞移植后创面存活率高；3、冻存活性微粒羊膜主要通过调控创面炎症反应、招募干细胞、促进新生血管化促进糖尿病创面愈合，同时羊膜基质能作为真皮替代物快速重构真皮结构。关键词：羊膜，微粒化，冻存，羊膜上皮细胞，糖尿病，创面愈合，巨噬细胞，血管化，真皮替代物．d．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究AbstractBackgroundDiabeticfootulcerisaseriouscomplicationofdiabetesmellitus，andapproximately25％ofdiabeticpatientssufferfromdiabeticlower-extremityulcerthroughouttheirlives．Even诵mthestandardtherapies，includingmoistdressing，debridement，infectioncontrol，andwoundoffloading，thesewoundsstillslowlyheal，and70／0-20％ofpatientswilleventuallyneedallamputationdespitestandardcaretreatment．ThedevelopmentofnewtherapiestotreatdiabeticwoundsandpreventfootulcersfromleadingtoamputationsiSthusurgent．Humanam／lionistheinnermostlayeroftheplacentaandconsistsofathinepitheliallayer，athickbasementmembrane，andanavascularstroma．TheuseofamnioticmembranesinskintransplantationWasfirstreportedintheearly1900sandshowedgreatpotentialinpromotingwoundhealing．Forthelast100years，thetherapeuticpotentialofhumanamnion／choriontissuegraftsinwoundhealinghasbeenwellestablishedbyhundredsofpublishedpaper，mainlybypromotingepithelialization，alleviatinginflammation，inhibitingscarformationandanti·infection．Inaddition，humanamnioticepithelialcells(rtAECs)retainahighlevelofpluripotencyandami310n-derivedcellularcytokinesolutiongreatlyimproveswoundhealinginacuteandchronicwoundmodels．Recently,ithasalsobeenreportedt11atHAECspromoteacutewoundhealinginmice．Despitethegreatpotentialofamnionintreatingvariouswounds，somedrawbacksshouldbeovercometomaximizeitsclinicalpotential．First，thepresentpreservationtechniques，suchasfreeze—drying，gammasterilizationorglycerolpreservation，leadtothecompletelossofHAECsviabilityofan'fflion．Second，humanamnionisverythin、Ⅳitlllowmechanicalstrength，thusa_qlnlonintheformoflargesheetsdoesnoteasilycompletelyflattenandadheretothewound，andgraduallydries，onlyusedclinicallyasatemporarybiologicaldressing．Inadditon，thetherapeuticcharacteristicsandmechanismsofHAECsdirectlyusedtotreatchronicwounds，suchasdiabeticulcers，arecurrentlyunknown．Inthisstudy,weprocessedhumanfleshamnionintomicronized(300--6000m)amnlonandfurthercryopreserveditinaserum—freestemcellcryopreservationmediumfor6months．neintactstructure，cellviabilityandbiologicallyactivecomponentsof一5．万方数据 第二军医大学博士学位论文micronizedam／lionaftercryopreservationwereevaluated．Post-thawingmicronizedamnionwasthentransplantedtothewoundsofdb／dbmicetoevaluateitseffectonrepairingfull-thicknessskindefects．Wefoundthattheintactstructure，cellmorphology，andcellviabilityoftheamnionwerewell·preservedbythiscryopreservationmethod．Topicaladministrationofcryopreservedlivingmicronizedarnnion(LMAM)significantlypromoteddiabeticwoundhealinginthedb／dbmousemodel，andtheHAECsofthecryopreservedLMMVlpossessedahighengraftmentpotentialaftertransplantation．Themechanismswerefurtherexplored，mainlyfocusingoninflammationandneovascularizationthroughinvivoandinvitroexperiments，andtheroleofamnioticmatrixasalong—termdermalscaffold．MaterialsandMethods1．Humanplacentas(20fetuses：10males，10females)weredirectlyobtainedfrompartudentsandcutbyself-mademicroskincuttertoobtain300-6001mamicroparticlestobeusedasLMAM．TheLMAMwereresuspendedinSTEM．CELLBANKEI—andthenpreservedinaliquidnitrogentankfor6months．TheeffectofcryopreservationonLMAMWasevaluatedbythefollowingexaminationsandfreshLMAMWasusedascontr01．(1)H&EstainingWasperformedtoexplorethes仉lcnlreofpost-thawLMAM(2)Live／deadassayWasconductedtodetectLMAMviability(3)ScanningelectronicmicroscopyWasperformedtodetectcellmembranestructureofHAECS(4)Livingmicronizedamnionconditionedmedium(LMAM-CM)Wascollectedandtheexpressionofgrowthfactors，chemokines，andinflammatorycytoldnesinLMAM—CMWasdetectedbyusinghumangrowthfactorantibodyarrayG1，humanchemokinearrayG1，andhumaninflammationantibodyarrayGl(RayBiotech，Inc．)2．Thedb／dbmicewererandomlyandequallydividedintothreegroups：LMAMgroup，DMAM(decellularizedmicronizedamnion)group，andblankgroup．CryopreservedLMAMorDMAMWassmearedonwoundsurfaceofthemicefromtheLMAMandDMAMgroups，respectively．ThefollowingtestswereperformedtoevaluatetheeffectofcryopreservedLMAMondiabeticwoundhealingaftertransplantation．(1)Photographsofgrossappearanceofthewoundsweretakenregularlyandthe．6．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究woundhealingratewascalculated．(2)H&EstainingWaSperformedtoexplorethehealedwoundstructureandLMAMdegradation．(3)H&EstainingandimmunostainingagainsthumanmitochondriaantibodywereusedtotracethefateoftransplantedHAECs，andtheTUNELassaywasconductedtodetectHAECapoptosis．(4)ImmunostainingagainstF4／80WasperformedtocountthenumberofmacrophagesandflowcytometrywasusedtoidentifyM1orM2macrophagesinthewounds．Expressionlevelsofthepro·inflammatorycytokinesandhealing-associatedcytokinesinthewoundsweremeasuredusingELISA．(5)FlowcytometrywereperformedtocountthenumberofEPCsinperipheralblood，andimmunostainingagainstCD34andCD31Wasconductedtocalculatethenumberofhematopoieticstemcellsandbloodvesselsinthewounds，respectively．3．LMAM-CMWascollectedandthefollowingtestswereperformedtoevaluatetheeffectofLMAM—CMonthefunctionofbonemarrow-derivedmousemacrophages，HUVECs，humanfibroblastsandkeratinocytes．(1)Cellproliferationofmacrophages，HUVECs，fibroblastsandkerafinoeyteswasassessedusingaCCK一8kit．(2)Cellmigrationofmacrophages，HUVECs，fibroblastsandkeratinocyteswasperformedusingtranswellchambersassay．(3)AngiogeniceffectofLMAM—CMonHUVECsWasmeasuredbytubeformationassay．(4)M1macrophagesWasinducedbyIFN吖andTNF-Ot．TheeffectofLMAM—CMonmacrophagespolarizationWasevaluatedbyobservingmorphologicalchangesofmacrophagesundermicroscope，andreal-timePCRtomeasureM1andM2macrophagesmarkergene．Results1．nleviabilityofthecryopreservedLMAMafterthawingWasdeterminedusingthelive／deadassayandcomparedwiththeresultoffreshLMAM，showingthat92．94％士2．27％and73．08％士2．95％ofHAECswereviableinthefreshandcryopreservedLMAM，respectively．H&Estainingrevealedthat，similartOthatinthefreshLMAM，asinglelayerofHAECsWasattachedtoathickbasementmembraneinthecryopreserved．7．万方数据 第二军医大学博士学位论文LMAMimmediatelypost—thawing．FurtherscanningelectronicmicroscopyanalysisshowedthatthemembranestructureofHAECsinthecryopreservedLMAMgroupremainedintactimmediatelypost—thawingandwassimilartothatinthefreshLMAMgroup．NoporeswereseenonHAECsmembraneinthecryopreservedLMAMgrouppostthawing．Ofthe41growthfactorsrepresentedinthehumangrowthfactorantibodyarray，AR，EGFR,CSF2，CSF3，HB-EGF，HGF，IGFBP．2，IGFBP一3，CSFlRNT．3，PDGFR，andTGF—BlinLMAM-CMshowedthehighestexpressionlevels．Ofthe38chemokinesrepresentedinthehumanchemokineantibodyarray，GRO，IL．8，MCP一1，andMIP—lbinLMAM—CMrevealedthehighestexpressionlevels．Ofthe39inflammatorycytokinesrepresentedinthehumaninflammationantibodyarray，IL一6，IL一8，MCP一1，MIP—lb，TGF-口l，TNF-6，andTIMP一2demonstratedthehi曲estexpressionlevels．Moreover，nearlyalltypesofcytokinesinLMAM-CMshowedmuchhigherexpressionlevelsthanthoseinAECs·CM．2．1Atday7afterwounding，thecryopreservedLMAMsurvivedwell，andthewoundWasmoistandruddy．Atday21afterwounding，mostofthewoundsinthecryopreservedLMAMgroupcompletelyhealed；theaveragewoundhealingrateinthisgroupWas94．64％士2．67％．whichWassignificantlygreaterthanthatinthecryopreservedDMAMgroup(80．52％土3．85％，P300mg／dL。采用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉，皮肤剃毛消毒后，在背部中线两侧皮肤分别制作直径1．2cm的全．．40．．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究层皮肤缺损创面。随机将小鼠分为三组：冻存活性微粒羊膜组(LMAM组)，冻存去细胞微粒羊膜组(DMAM组)，空白对照组(BLNAK组)。分别将LMAM、DMAM均匀滴涂在创面后，予以无菌凡士林纱布覆盖，采用4．0号线间断缝合固定凡士林纱布与创周皮肤。术后14天、21天、28天分别拍照，图形软件Image．Pro计算创面愈合率。创面愈合率(％)=(1．残余创面面积／初始创面总面积)×100％。移植术后第5天、35天、60天取材，石蜡包埋后行HE染色观察创面羊膜上皮细胞生长和羊膜降解情况。石蜡包埋和HE染色方法与论文第一部分相同。(二)TUNEL染色检测羊膜上皮细胞凋亡1．石蜡切片依次二甲苯脱蜡，在乙醇中以降浓度梯度水化，最后放入蒸馏水中静置10分钟，PBS漂洗2次：2．201xg／ml不含DNase的蛋白酶K37℃作用20分钟：3，PBS漂洗3次将蛋白酶K漂洗干净；4．制备TUNEL检测液(其中含509lTdT+450I_d荧光素标记的dUTP液)，充分混匀，每个标本加50“1TUNEL检测液，37。C避光孵育60分钟；5．PBS漂洗3次；6．用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。激发光波长为450．500nm，检测波长为515．565nm。(三)免疫组化染色通过免疫组化检测不同抗体：抗人线粒体MTC02抗体染色追踪移植的人羊膜上皮细胞，抗鼠F4／80抗体染色检测创面巨噬细胞个数，抗鼠CD34抗体染色计算创面造血祖细胞数量，抗鼠CD3l抗体染色计算创面新生血管数目。实验步骤：1．石蜡切片依次二甲苯脱蜡，在乙醇中以降浓度梯度水化，最后放入蒸馏水中静置10mira2．PBS液漂洗，5minx3次；3．组织切片在3％H202去离子水中室温孵育15—30min，灭活内源性过氧化物酶；4．PBS液漂洗，5min×3次；5．切片置入高压锅中采用PH6．0的0．01M柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，自然环境冷却至室温；6．PBS液漂洗，5min×3次：7．用5％二抗来源血清封闭，4℃下过夜；．41．万方数据 第二军医大学博士学位论文8．滴加一抗：CD31(1：50，Abcam，USA)、CD34(1：100，Abeam，USA)、F4／80(1：50，Abeam，USA)、以及MTC02(I：200，Abcam，USA)，4℃孵育过夜；9．PBS液漂洗，5min×3次；10．加相应二抗(用含I％BSA的PBS液稀释)，37℃孵育lh；11．PBS液漂洗，5minx3次；12．DAB显色液显色，苏木精衬染；13．显微镜下观察。(四)流式细胞术流式细胞术用于检测外周血中内皮祖细胞数量及创面M1、M2型巨噬细胞比例。1．流式细胞术检测外周血中内皮祖细胞数量实验步骤(1)取规格2ml流式管，每管加入1001xl小鼠外周血；(2)加入一抗CDl33(1：100，eBiosciences，USA)、VEGFR-2(1：100，eBiosciences，USA)及相应的同型对照抗体，室温避光孵育30min；(3)加入1．5ml1×红细胞裂解液，震荡，室温避光孵育20min；(4)离心，2000rpm×5min，弃上清液；(5)加入PBS洗涤2次；(6)将细胞重悬于20％1PBS中，混匀，上机检测。2．流式细胞术检测创面M1、M2型巨噬细胞比例实验步骤(1)取创面皮肤以组织剪充分剪碎后置入0．1％I型胶原酶溶液中，37"C恒温摇床消化1小时，200目过滤网过滤细胞悬液，离心收集细胞，PBS重悬；(2)分别加入一抗APC标记的F4／80(1：100，BioLegend，USA)、PE标记的CCR7(1：100，BioLegend，USA)、PE／Cy7标记的CD206(1：100，BioLegend，USA)及相应的同型对照抗体，室温避光孵育30min；(3)加入1．5ml1×红细胞裂解液，震荡，避光孵育20mira(4)离心，2000rpmx5min，弃上清液；(5)PBS洗涤2次；(6)将细胞重悬于200．1PBS中，混匀，上机检测。(五)ELISAELISA检测创面中促炎因子(IL．1D，IL．6，TNF一伐)与促创面愈合因子(IL一10，TGF—Bl，IGF．1)的表达。．42．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究EUSA实验步骤：1．皮肤创面取材，按1：1比例加预冷PBS及蛋白酶抑制剂在杜恩斯匀浆器中匀浆，10000rpm速度4℃离心20min，取上清液；2．ELISA相应孔板中加入不同浓度标准品及组织上清液，每孔100“1；3．’轻轻混匀30秒，封板膜封住板孔，37℃孵育60min；4．甩尽板内液体，用洗涤液反复洗涤5次，确保洗板干净；5．每孔加入相应的酶标记特异性抗体，封板膜封板，37℃孵育30min；6．甩尽板内液体，用洗涤液反复洗涤反应板5次，确保洗板干净；7．每孔加入50111底物A和509l底物B，室温避光孵育5mira8．每孔加入100I-tl终止液，即刻在450nm处读取OD值；9．绘制标准曲线，计算出样品浓度。(六)细胞分离培养1．原代表皮细胞和成纤维细胞的分离培养方法如下：手术室无菌条件下取废弃包皮，用4"C含双抗的无菌生理盐水反复清洗包皮至血迹完全去除，无菌台中修剪包皮去除皮下组织。将包皮修剪为长方形小皮片后放入4"C冰箱中，用0．5％分离酶溶液消化过夜。次日用无菌镊分离表皮层及真皮层，表皮层继续用O．25％胰蛋白酶／EDTA溶液在37℃恒温摇床中消化20分钟，随后用胎牛血清液终止胰蛋白酶消化。真皮层组织用组织剪剪成真皮颗粒，37℃恒温摇床中采用0．1％I型胶原酶消化2．4h，直至颗粒状真皮完全溶解。200目金属过滤网过滤后离心收细胞，表皮层细胞接种到铺有Ⅳ型胶原的培养皿中，采用无血清培养基(K—SFM，Gibco)培养；真皮层成纤维细胞接种于细胞培养瓶中，用10％FBS的DMEM培养基培养。2．原代骨髓来源巨噬细胞分离培养方法如下：6．8周龄C57dx鼠颈椎脱臼致死后用75％酒精消毒，无菌条件下分离股骨和胫骨，DMEM液冲洗骨髓，重复2．3次。离心收集细胞，重悬于条件培养基中(含20ng／mlM．CSF的PRMI．1640完全培养基)。37℃、5％C02中培养72h后，更换为新的条件培养基。从第4天开始每天更换条件培养基直至第7天骨髓来源细胞完全分化成成熟的巨噬细胞。采用流式细胞术检测F4／80阳性巨噬细胞细胞比例，纯度达到95％以上时培养的巨噬细胞可以用作下一步实验。流式细胞术方法同上。3．人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养人脐静脉内皮细胞购买于ScienCell公司(SanDiego，USA)，采用含10％FBS的内皮细胞基础培养基ECM(Gibco，LifeTechnologies)培养。-．43．．万方数据 第二军医大学博士学位论文(七)细胞增殖活性检测采用CCK一8试剂盒检测细胞增殖活性。接种细胞于96孔板内，每孔细胞5×103个，采用含10％FBS的高糖DMEM液培养24h后，将培养基换为200pLLMAM．CM或200pLDMAM—CM继续培养724"时。每孔加入20山CCK．8检测液，继续培养3h后，吸取100p1上清液转移至新的96孔板，酶标比色仪(Biotek，USA)450nm下测定吸光度OD值。含10％FBS的高糖DMEM液为阳性对照而高糖DMEM液为阴性对照。(八)细胞迁移能力检测采用孔径为8gm的24孑LTranswelld,室检测细胞迁移能力。细胞以无血清高糖DMEM液重悬后置于Transwell4,室上室培养，每孔105个细胞，下室加入600pLLMAM．CM或者600pLDMAM—CM并保持上下室液面一致。继续培养24小时后取下小室，用棉签刮除上层细胞，结晶紫染色，显微镜下拍照，用Image．ProPlus图像分析软件计数穿膜细胞个数。下室中加入含10％FBS的高糖DMEM液为阳性对照而高糖DMEM液为阴性对照。(九)血管内皮细胞成小管实验采用Matrigel基质胶检测不同培养基对血管内皮细胞成小管能力的影响。取4℃冰箱过夜的Matrigel基质胶按2：l的比例用内皮细胞基础培养基ECM稀释，96孔板每孔力1]A50pL稀释后的Matrigel基质胶，37℃孵育30分钟使其固化。LMAM．CM或者DMAM．CM重悬人脐静脉内皮细胞(密度4x105／m1)后，每A；b1]入100山细胞悬液。37℃、5％C02细胞培养箱中继续培养6d,时后倒置显微镜下观察小管形成个数。10％FBS的高糖DMEM液为阳性对照而高糖DMEM液为阴性对照。(十)LMAM．CM对巨噬细胞极化检测取对数生长期的巨噬细胞按2×105／ml密度重新接种于6孔板，每A500¨l。待细胞增殖到70％融合时，分别更换培养基为10％FBS+LMAM—CM、10％FBS+DMAM—CM、10％FBS+高糖DMEM继续培养24／．I'时。IFN-T(20ng／m1)和TNF—a(20ng／m1)联合刺激细胞24小时后，倒置显微镜下观察细胞形态，并采用real．timePCR检测M1、M2型巨噬细胞标志物基因CCR7、CD206的表达。10％FBS+高糖DMEM培养基培养的、无IFN—Y+TNF—o【刺激的巨噬细胞为空白对照组。(十一)Real．time定量PCR1．Trizol法提取细胞总mRNA．44．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究(1)将六孔培养板中的贴壁细胞用4"C预冷PBS溶液洗2次后，每孔加入lmLTRIzol试剂室温裂解5min。(2)将裂解液吸入1．5mLEP管中，加入200pL(1／5体积裂解液)三氯甲烷充分颠倒混匀，室温静置10min。(3)于4"C下120009离一心15min，将上层水相液体(约500止)吸入另一1．5mLEP管中。(4)在上层水相液体加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，沉淀mRNA。(5)于4℃下120009离-t),10min，mRNA形成白色沉淀沉于管底，移去上清液，加入预冷的75％乙醇，悬浮沉淀。(6)于4℃下120009离一t),5min，彻底移去上清液，加入20pLDEPC水溶解。2．mRNA逆转录为cDNA(PrimeScriptRTMasterMix快速反应体系)(1)测定提取的mRNA浓度，计算各样本中l飕mRNA所需的体积。(2)将4pL的PrimeScriptRTMasterMix(5X)(含有PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer)与提取的1岭模板mRNA混匀，并用DEPC水补足为20止，充分混匀。(3)将混匀的反应混合液置于PCR扩增仪中，设置反应条件为：37。C15min一85"C5sec-_4℃5sec，反应结束后．20℃保存。3．实时定量PCR扩增(SYBRGreenI法)(1)每个样品做3个复孔，采用lOgL反应体系：SYBRPremixExTaq(2x)5uL、扩增基因上游引物0．29L、扩增基因下游引物O．2pL、Rox反应液0．2皿、样品eDNA21．tL、DEPC水2．4止，总共10I．tL，充分混匀。(2)将混匀的反应混合液置于实时定量PCR仪中，设置反应条件为：95。C15sec一95℃5sec．60℃30sec一72℃30sec，扩增40个循环。(3)反应结束后将数据导出至1]Excel表中，采用AACt法进行相对定量分析，检测目的基因的表达变化。采用PrimerPremier6．0设计引物，交由上海生物工程有限公司合成，各引物序列如下：CCR7：5’一TGAGGTCACGGACGATTACAT．3’and5’．GTAGGCCCACGAAACAAATGAT一3’：CD206：5’一CTACAAGGGATCGGGlvITATGGA．3’and5’一TTGGCATTGCCTAGTAGCGTA一3’：GAPDH：5’-AGAACATCATCCCTGCATCC．3’and5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA一1’万方数据 第二军医大学博士学位论文三、统计分析本部分数据采用spssl6．0进行分析，首先采用Shapiro—Wtlk和Levene法检查数据是否符合正态分布和方差齐性。如果符合，则数据表示为均数4-标准差。两组间数据比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P0．05，Figure4A)。移植后第lO天，LMAM组创面巨噬细胞数量急剧减少(37．3士7．9／hpf)，而DMAM组及BLANK组创面巨噬细胞数量继续增加，分别为80．2土10．5／hpf和100．0士13，4hapf，均明显高于LMAM组(P<0．001。Figure4B)。进一步我们探究冻存活性微粒羊膜对创面巨噬细胞表型转换的影响。CCR7为MI型巨噬细胞标志物而CD206为M2型巨噬细胞标志物，我们采用流式细胞术来计算创面第10天F4／80阳性巨噬细胞中CCR7阳性和CD206阳性细胞比例，发现LMAM组中创面CCR7阳性巨噬细胞占总F4／80阳性巨噬细胞比例为4．91士0．88％，明显低于DMAM组(11．56+1．32％，P<0．001)及BLANK组(11．75+1．43％，P<0．001)，而DMAM组与BLANK组间无统计学差异(P>0．05)；LMAM组中创面CD206阳性巨噬细胞占总F4／80阳性巨噬细胞比例为25．66-J：2．08％，明显高于DMAM组(12．06士1．69％，P<0．001)及BLANK组(11．74+1．80％，P<0．001)，而DMAM组与BLANK组间无统计学差异(P>0．05，Figure5)。最后，我们采用ELISA检测移植后第10天创面促炎因子(IL．1p，TNF—a，IL一6)及促创面愈合相关因子(VEGF,IGF．1，TGF．p1)的表达。相比于DMAM组及BLANK组，LMAM组创面促炎因子IL．113，TNF．a，IL-6的表达明显低于其他两组(Figure6A～C)，而促创面愈合相关因子VEGF,IGF．1，TGF一131的表达明显高于其他两组，结果均具有统计学意义(Figure6D—F)。万方数据 第二军医大学博士学位论文A攀爹鬻≤蠹爱￡囊麓。≮誊。～．～《吁冀≤警≯i}l啦抛僻僻*o●■一函～自～B鬻鬻Figure4．fA-B)Woundtissuesw℃mharvestedandstainedwithamacrophage—specific衄tibodyF4／80atday5(A)andday10(B)aRcr”ansplanmfion5daysafterwounding，thecellsthatstainedpositivelyforthemaemphage-specificmarkerF4／80weremorepmval朗tinthewo衄dsoftheeryopreseⅣedLMAMgroupthanthoseintheo"pmsⅡvedDMAMandblankgr。lⅢs(A)Imefestingty,thenⅧberofinfdtratedmacrophagessignifimtlywduc“inthec。”p㈣dLMAMgroupl0daysafterwo姐dmgthanthc‘einthe汀归阻eedDMAMandblankgroups(B)n26Statisticalanalysiswasperformedbyone-wayANOVA++P‘001．P‘0001andnsDosignificance万方数据 查查墨些丝垫±壁堡壁墨堕型重量鱼盟笪旦墨垫型堡至—o∞寻L：lo孚)sui止Figure5．FACSanalysisdeteminedtheF4／80+CCR71MIandF4／80+CD206+M2macrophagesaI“y10fromthediabeticwoundsofthec‘”p喁eⅣedLMAMgroup，eryopreservedDMAMgroup，andblankgroup,showingthattheeryopreservedLMAMsignificantlyreducedMImacrophagesandincnasedM2macrophagesinday10wounds船determinedbyFACSana时sis，whereastheclyopreservedDMAMmdnotsignificantlyaffectMIorM2macmphagcsin血ewounds6StatisticalandB,s．110significanceanalysiswasperformedbyone-wayANOVAP‘0001万方数据 第二军医大荦博士擘住论文A增；蓬；蛐㈣}攫}埘|C互孰5|瓤7|毽Figure6．(A-C)Expres“onlevelsofthepro—inflammatorycytokinesIL—113，IL一6，andTNF-q“day10inthewoundsofthethreegroupsweremeasuredusingELISAshowingthattheexpressionlevelofJL·J髓TNF-a，andIL-6s／gnlficangyreducedinthecryopreseⅣedLiVlA／vl—treatedwoundsandVEGFatday10inthewoundsofthemfeegroupsm㈣dusingELISA，revealingthatcomparedwiththoseintheothertwogroups(D—F)H髓ling-assoeiatedcyloldnesTGF·131，IGF-1，thelevelsofTGF·131，IGF-I，andVEGFsignificantlyincreasedinthecryopreservedLMAM-Irea【cdwo皿ds”6Statisticalanalysisw∞performedbyone-wayANOVA+P‘005，++p<0Ol，andP‘0001四、冻存活性微粒羊膜对创面新生血管化的调控移植后第5天流式细胞术检测外周血CDl33+VEGFR2+EPCs数量，显示LMAM组EPCs占循环单核细胞比例为o51±006％，明显高于DMAM组(0．32土007％．P<0001)及BLANK组(014±005％，P<0001)，而DMAM组也显著高于BLANK组，两组间有统计学差异(P<0001，Figure7)。免疫组化染色CD34抗体检测移植后第5天创面造血祖细胞数晕，显示LMAM组创面CD34阳性细胞数量为348±68个／hpr,明显高于DMAM组(240士52／hpf,P<001)及BLANK组(92±32／hpf,P<0001)．而DMAM组和BLANK组两组问也有统计学差异，DMAM组创面CD34阳性细胞数量明显高于BLANK组(P<000I，Figure8)。移植后第14天和21天分别取材肉眼观察刨面新生血管化程度．显示创面第14天LMAM组创面红润，新生血管化速度明显快于DMAM组及BLANK组：创面第21天DMAM组血管化增加，万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病岳j面愈合的作用及机制研究与LMAM组类似，两组新生血管化明显高于BLANK组(Figure9)。进一步我们采用免疫组化染色检测移植后第14天创面CD31阳性血管数量，发现LMAM组CD3I阳性血管数量为442士58／hpf,显著高于DMAM组(268±63／hpf·P<0001)及BLANK组(170“l／hpf，P<0001)，且DMAM组与BLANK组间也存在统计学差异(P<001，Figure10)。A葺口匠Figure■(A)FACSmlysisdeterminedmeCD]33+VEGFR2+EPCsal血y5in山eperipheralbloodofthecryopreservedLMAMgroup，cryopreservedDMAMgroup，andblankgroupRepresentativepicturesofFACSresultsshownfBlQuantitativeanalysisofCDl33+VEGFR2+EPCsintheperipheralblood，showingthatthepercentageofEPCsinthecryopreservedLMAMgroupwassignificantlyhigherthanthatinthecryopteservedDMAMgroupandblankgroupn=6Statisticalanalysiswasperformedbvone-wayANOVAP<0001万方数据 ．!兰!!垄!量±芏堡丝圭蒸燧瓣黪≤c霪熏萋．，■-J～鬟搭基强j：羔≥．蔫ou，；‘．．：j÷÷毫j。E￡i—iFigure8·(A-c)Specimensfromday5woundswe∞stainedwithCD34．theheⅡm‘opoieticprog“totcellmarkerRepresentativepicturesofCD34staininginc”yapreservedLMAMgroup(A)，cryoprescrcedDMAMgroup(B)，andblankgroup(C)wemshowⅡNewsklacapillari㈣mformedbytheCD34+cellsinthevicinityofthecrsapreservedLMAMBlack唧wsⅢdKⅫmeCD34+capillaries(D)QuantitativeanalysisofCD34+cellsinthewounds，show岫thattheCD34+ceils”mmoreprevalentinthewoⅡdsofthec‘yopRⅫedLMAMgroupthanthoseinthocryopresedvedDMAMgroupandblankgroup5daysafterIa'ansplamatinn㈣6Statisticalanalysisw∞performedbyone-wayANOVA+_p‘001andp<000lSealeb∞．50Ⅲ万方数据 LMAMDMAMBLANK14d21dFigure9Grossobservationofncovascuinrlzafionatday14and21inmewoundsofthec叫opreservedLMAMgroap．mecryoprescrvcdDMAMgroupandblankgroupThewoundareawassurroundedbydottedl如itrevealedthatneovascuinrizationwasmoreobviousinthcryopreservedLMAMgroupthanthaiinmeothertwogroupsatdavsl4and21afterwounding万方数据 第二军医太学博士学位论文F'igun10．(A-c)Specimensfromday14woundswerestainedwithCD3]，abloodvesselendothelinmcellmarker．RcptesenfativepicturesofnewlyformedvesselsincryopreservedLMAM目,oup(AXcq,opreservedDMAMgroup(B)，andblankgroup(c)w哪shown(D)Quanfitagveanalysisofneovascularinatinn，showingthatthcnumrofthenewlyformedvesselsincO‘op”se“edLMAMgroupwetssignificantlyhigherthanthatincW‘％er”dDMAMandblankgroup㈣6S僦bdcalanaIysiswasperformedone-wayANOVA+～<001andP<0001Scdebybats：50pm万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究五、体外实验探讨冻存活性微粒羊膜条件培养基LMAM．cM对巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及表皮细胞的调控作用动物实验我们发现LMAM组创面愈合率明显快于DMAM组及BLANK组，而LMAM组与DMAM组之间的主要区别在于LMAM组含活性羊膜上皮细胞，且移植后能在创面后能长时间存活，提示活性羊膜上皮细胞在创面愈合中发挥着重要作用。进一步免疫组化标记抗人线粒体抗体来追踪羊膜上皮细胞转归时我们发现染色阳性的羊膜上皮细胞均匀环绕于羊膜基质周围并与羊膜基质紧密粘附，仅非常少量羊膜上皮细胞迁移离开羊膜基质，提示活性羊膜微粒中羊膜上皮细胞可能主要通过旁分泌作用而非转分化作用来促进创面愈合。为验证我们的假设，我们收集冻存活性微粒羊膜条件培养基并通过体外实验探讨其对创面愈合中起主要作用的四种细胞(巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及表皮细胞)功能的影响。(一)LMAM．CM对巨噬细胞的调控作用正常完全培养基条件下原代巨噬细胞小而圆，未见细胞突起。IFN-y+TNF—d联合刺激后，倒置显微镜下观察发现其呈M1型巨噬细胞形态，细胞伸出许多突起，呈树突状；DMAM．CM对IFN-y+TNF—cL刺激后的巨噬细胞形态无改变，而LMAM—CM诱导巨噬细胞延长，树突状结构明显减少甚至消失，提示LMAM．CM可诱导炎症因子刺激下的M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化(Figure11)。进一步PCR检测CCR7(M1型巨噬细胞标志物)mRNA表达及CD206(M2型巨噬细胞标志物)mRNA表达，发现IFN．Y+TNF—u刺激后巨噬细胞CCR7的表达显著升高，为对照组的11．9倍，而LMAM．CM可显著抑制IFN-y+TNF—c【刺激后CCR7的高表达，LMAM—CM+IFN．丫+1NF．0【组CCR7的表达仅为对照组0．5倍，DMAM—CM无此抑制作用。CD206的表达呈现相反的结果，IFN—v+TNF一0【刺激后巨噬细胞CD206的表达仅为对照组0．6倍，而LMAM．CM能逆转IFN．1，+TNF一0【刺激后CD206低表达，LMAM．CM+IFN吖+TNF．0L组CD206的表达为对照组8．6倍，DMAM—CM对IFN—Y+TNF一晓刺激后巨噬细胞CD206的表达无影响(Figure12)。随后我们采用Transwell小室检测LMAM．CM对巨噬细胞迁移能力影响，发现LMAM—CM能显著增加巨噬细胞迁移能力，LMAM．CM组每高倍镜视野下迁移的巨噬细胞个数为94．3+5．7，明显高于DMAM—CM组(50．5+7．7／hpf，P<0．001)、阳性对照组(69．3士8．0／hpf，P<0．001)及阴性对照组(49．3士7．9／hpf，P<0．001)。DMAM—CM组与阴性对照组无万方数据 第二军医大学博士学位论文差异(P>005。Figure13)。CCK-8试剂盒用于检测LMAM．CM和DMAM-CM对巨噬细胞增殖的影响，发现LMAM—CM及DMAM—CM对巨噬细胞增殖无促进作用，细胞增殖活性与阴性对照组结果类似，之间无统计学差异(P>005，Figure14)，且均明显低于阳性对照组(P<0001)。ControlMediaTNF-a+IFN-vLMAM-CM+TNF—a+IFN·VDMAM-CM+TNF·a+IFN—V脚M11Morphologicalchangesmmacmapimge曲enoi3,】oesstimulatedwithLFN-7andTNF-ttwithOrwithoutLMAM￡MandDMAM-CM10％FBSwithoutlFNqandTNF-Uwasserved越theconⅡolmediumThemacrophagesheatedwithcontrolrmdiaadheredontotheplateasasmallroundsUllctufethatfailedtospread．IFN-．f+TNF·ncausedmanymacrophagestoprojectrlumerou．qprotrusions。rcsditingindendriticmorphology,whereaslFNl+TNF-a十LMAM-cMinducedelongationoftheceHs，whichdidnotdisplayl3umcrou$projections“observndinthecells∞¨intheIFNq+TNF·qcellmediumDMAM-CMcouldnotinduceanymorphologicalchangesofnlacfophagesstimulatedwithJFNl+TNF·ⅡScalebars：50pm万方数据 堡壹兰坚壁垫±壁堡苎垦苎型堕垒全丝笪旦墨垫型堑茎宕Ip沮|1山2e一兰￡E蛊uuFigurel2．ExpressionofCCR7rMlmarker)andCD206(M2marker)after吮atmentwithdifferentmothacontainingc帅kb瞄(tonalIFN-T+TNF-％IFN?+TNF·a+DMAM-CMandIFN-T+州F龟+LMAMcM)呲detectedbyq-PCR，showingthatLMAM-CMstrong时up唧uhl酣theM2macrophagetTlarkcfCD206anddownregulatedtheMImarkerCCR710％FBSwithoutIFNq"andTNF-aWaSservedasthecontrolmediumandallresultswe∞eomparedwithcOBtrOImediumn=3Statisticalanalysisw够performedbyone-wayANOVA‘‘P‘OOland+¨口<00017-●一々，．-’ikNegatl”ControlDMAM．CMnH，．．口●t№霜jFigure13．EffectofLMAM-CMODthemigrationofmacrophageswasdeterminedusmgthetranswellassay,showingthat¨dAM·CMslgaifican岫promotedmemigrationofmacrophagesHigh-glucoseDMEMsupplementedwith10％FBSwasused丛positivecontrolandhIgh-glucoseDMEM如negatDecontrol，respectively．nffi6Statisticalanalysisw∞performedbyOBe—wayANOVA+¨P‘0001andns．BOsignificanceSeakbars：10011111万方数据 第二军医走学博士学位论文o：>ooPositiveLMAM-CMDMAM-CMNegativeFigure14．EffectofLMAM-CMontheproliferationofmacrophageswasdeterminedusingtheCCK-8assay,showingthatLMAM-CMdemonstratedNoconsiderableeffect013theproliferationofmacmphagesHi窖h-glucoseDMEMsupplementedwith10％FBSwasused勰positivecontrolandhigh-glucoseDMEM鹊negalivecontrolrespectively．㈣6Statisticalanalysisw“performedbyone·wayANOVA’++P005)。进一步比较DMAM—CM组和阴性对照组，发现DMAM—CM能增强HUVECs迁移能力(P<0001，Figure16)。最后我们采用CCK．8万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用厦机制研究法检测LMAM-CM对HUVECs增殖的影响，发现LMAM—CM能显著促进HUVECs增殖，细胞增殖活性明显高于阴性对照组(PooPositiveLMAM-CMDMAM-CMNegativeFigure17．EffectofLMAM-CMontheproliferationofHUVECswasdeterminedusingtheCCK‘8assay,showingthatLMAM—CMsignificantlypromotedtheproliferationofHUVECsH岫一glucoseDMEMsupplementedwith10％FBSwasused8sposgivecontrolandhi曲一glucoseDMEM罅negat／vecotttrol，respectwe时n6Statisticalanalysisw∞performedbyone-wayANOVAP‘0001万方数据 堡墨墨些整垫±堡堡塑墨苎型重壁全丝笪旦型!型堑塞(三)LMAM-cM对成纤维细胞的调控作用Transwell小室用于检测LMAM—CM对成纤维细胞迁移能力影响，发现LMAM—CM能显著增强成纤维迁移能力。LMAM-CM组每高倍镜视野下迁移的成纤维细胞个数为3442i302，明显高于阴性对照组(745：b167／hpf，P<0001)和DMAM-CM组(153．3i296／hpf，P<0001)，且与阳性对照组结果类似(3355±289／hpf,P>005)。DMAM．CM组成纤维迁移能力也显著高于阴性对照组(P<0．001，Figure18)。CCK-8法检测LMAM．CM对成纤维细胞增殖能力的影响，发现LMAM—CM显著促进成纤维细胞增殖，细胞增殖活性显著高于阴性对照组(P<0．001)和DMAM-CM组(P<0001)，但低于阳性对照组(P<0001)。DMAM．CM组和阴性对照组间也存在统计学差异，DMAM-CM组成纤维细胞增殖活性明显高于阴性对照组(P<0叭，Figure19)。一莲麟HFigurel8．EffectofLMAM-CMOilthemigrationoffibroblastsw船determinedusingthetI|answellassay,showingthatLMAM_‘]Msignificantlypromotedthemigrationoffibroblastsnigh-glucoseDMEMsuppleraentedwith16％FBSwasusedaspositivecontrolandDMEMashigh-glucosenegativecontrol，respectively．m6StatisticalanalysisWagperformexlbyone-wayANOVAP<0001andns．nosi口ificanceScaleb啦!00pro万方数据 第二军医大学博士学位论文onI心>凸oPositiveLMAM—CMDMAM—CMNegativeFigurel9．EffectofLMAM—CMOntheproliferationofflbrobl踮tswasdeterminedusingtheCCK-8DMEMsupplementedwith10％FBSusedcontrolandhigh·glucoseDMEM∞assay,showingthatLMAM-CMsimilarlypromotedtheproliferationoffibroblastsHigh-glucosepositivenegativecontrol，respectively．n=6StatisticalanalysiswasperformedbyonewayANOVAP‘0001(四)LMAM．cM对表皮细胞的调控作用我们采用Transwell小室检测LMAM—CM对表皮细胞迁移能力影响，发现LMAM．CM能显著增强表皮细胞迁移能力。LMAM—CM组每高倍视野下迁移的表皮细胞个数为4860+-358，明显高于阴性对照组(900a：241／hpf，P005)。DMAM．CM组和阴性对照组问也存在统计学差异，DMAM—CM能增强表皮细胞迁移能力(P005)。同时，DMAM—CM组表皮细胞增殖活性也明显高于阴性对照组(P<001，Figure2I)。万方数据 苎生茎：些丝垫±垦堡苎墨堑型亟垒全堕堡墨!堕型堑墨PositiveContoJLMAM-CMFigare鼍20EffectofLMAM-CMonthemigrationofkemtlnocyteswasdetermined量usingthetzanswellassay,showingthatLMAM—CMsignificantly肿珊ledmmigrationofkeratinocytesaigh-#ue璐eDMEMsupplementedwith10％EBSwasused拈positiveconⅡDlandhigh-glucoseDMEMasnegativecontrol，respectively．n=6Statisticalanalysisw舶performedbyone-wayANOVA+’+P‘0001andB．s，IiosignificanceScalebars：lOOlunⅢnI嵋>凸oPositiveLMAM·CMDMAM-CMNegativeFigure21EffectofLMAM-CMOlltheproliferationofkemlinocytesw越determinedusingtheCCK-8assay,showingthatLMAM-CMsignificantlypmmotedtheproliferationofkeratinocytesH讪-glucoseDMEMsuppkmcntedwith10％FBSwasusedaspofidvecontrolandhi曲-gincoscDMEMasnegativecontrol，resp％帆cly．n--6Statisticalanalysiswasperformedbyone-wayANOVAP‘0001andn&．Besignificaaee万方数据 第二军医大学博士学位论文讨论糖尿病创面难愈机制复杂，涉及因素较多，理想的治疗方案应该是能同时改善包括炎症、血管化、上皮化及真皮重构等在内的创面愈合多个环节，恢复多种细胞、细胞因子与细胞外基质正常而有序的相互作用。本部分研究我们局部应用冻存活性微粒羊膜治疗糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面，发现其能显著促进慢性创面愈合。移植后微粒羊膜中羊膜上皮细胞能在创面长时间存活，通过旁分泌机制能早期募集巨噬细胞至创面引起糖尿病创面急性炎症反应并促进巨噬细胞从M1型向M2型转化，同时活性微粒羊膜也能旁分泌因子促进造血祖细胞募集到创面，增强创面新生血管化。不仅如此，羊膜基质还能作为真皮替代物长期存在于创面皮肤促进创面真皮重构。进一步我们通过体外实验探究冻存活性微粒羊膜条件培养基对皮肤创面愈合过程中四种主要细胞(巨噬细胞，内皮细胞，成纤维细胞及表皮细胞)功能的影响，发现其能体外促进巨噬细胞表型转化、增强血管内皮细胞体外成小管能力并能调控巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及表皮细胞的增殖迁移。干细胞在刨面愈合中作用为许多文献所证实，目前研究较多且较有希望转化到临床的主要有骨髓间充质干细胞及脂肪间充质干细胞。wh等2007年首次应用人骨髓间充质干细胞治疗急慢性创面，发现间充质干细胞能转分化为创面细胞并旁分泌生长因子促进新生血管形成进而促进创面愈合[∞51。随后陆续多项研究证实人骨髓间充质干细胞在创面愈合中的作用，主要通过旁分泌机制分泌多种生长因子调控创面炎症反应，增加创面新生血管化及加速创面上皮化[106。09]。但人骨髓问充质干细胞来源有限，获取时为有创操作且会引起捐献者疼痛，从而限制其大规模临床使用。脂肪来源间充质干细胞亦在创面修复中表现出巨大临床潜能，其作用机制与人骨髓来源问充质干细胞类似【110．111】。脂肪来源问充质干细胞主要通过脂肪抽吸提取干细胞，较好的解决了间充质干细胞的来源有限难题，但仍需较复杂工艺提取间充质干细胞，且应用于创面后存活率低并有致瘤风险。由于干细胞强大的分化潜能且能持续性旁分泌多种因子调控创面愈合过程中多种细胞、多个环节而加快创面愈合，在临床创面修复中有巨大的应用潜能。寻找新的来源广泛、临床易取、无伦理学争议且疗效肯定的干细胞促进创面愈合仍有重大的临床意义。羊膜上皮细胞很好的满足了这些特点，其临床易获取、无免疫源性、无致瘤性且无伦理学争议，近年来在再生医学中受到越来越多的关注。前文我们己讨论已有一些报道为采用人羊膜上皮细胞进行创面修复提供了一定的理论依据，人羊膜上皮细胞浸提液表达PDGF、ⅦGF、angiogenin、TGF—D2、TIMP—l及TIMP．2等因子郴J，体外促进表皮细胞及成纤维细胞增殖、迁移，创面局部注射人羊膜细胞浸提液后创．68—万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究面上皮化速度加快阢2¨。采用人羊膜上皮细胞促创面修复动物实验报道很少，jin发现局部创周注射人羊膜上皮细胞能通过分化为表皮细胞和旁分泌EGF，PDGF-B和IL一8等因子促进创面上皮化加速创面愈合【521。Zhou等在大鼠压力性溃疡模型中也证实人羊膜上皮细胞的治疗作用，但机制不清，可能与上调创面VEGF促进血管化和下调TNF—a等炎症因子有关【112】。到目前为止仍缺乏研究探讨人羊膜上皮细胞在糖尿病创面中的修复作用，本研究中我们应用冻存复苏后的活性微粒羊膜修复糖尿病小鼠全程皮肤缺损创面，发现羊膜上皮细胞能在创面存活良好并呈复层生长的趋势，这为探究人羊膜上皮细胞在糖尿病创面修复中的作用及其机制提供了先决条件。干细胞移植后低存活率及致瘤性一直是干细胞临床应用中的瓶颈问题。wu等采用GFP荧光标记骨髓间充质干细胞，发现移植于创面后第7天仅有27％细胞存活，第14天时这一数值下降为7．6％1105】。在本研究中我们发现移植冻存复苏后的活性微粒羊膜至糖尿病创面后羊膜上皮细胞在创面存活良好并呈复层生长的趋势，细胞存活率明显高于之前直接将干细胞创周注射修复创面的报道。分析活性微粒羊膜中羊膜上皮细胞创面移植后存活率高的原因可能基于以下两个方面：1．羊膜基质能为羊膜上皮细胞的粘附、生长、增殖提供合适的微环境，促进羊膜上皮细胞创面移植后存活。干细胞niche在干细胞增殖、分化、迁移、粘附及干细胞干性的维持中发挥着重要作用[58】。将间充质干细胞接种于胶原支架进行培养后移植于全层皮肤缺损糖尿病创面，能使间充质干细胞存活良好，创面血管化增加且创面愈合速度加快【1131。Schmitt将间充质干细胞接种于海藻酸钙凝胶，发现细胞能在凝胶中存活6周之久，且能良好保存间充质干细胞分泌VEGF和bFGF等细胞因子的能力【114J。我们实验室前期多篇文章验证了去细胞微粒羊膜能为干细胞生长提供合适微环境，羊膜含有人体内最厚的基底膜，羊膜基质成分类似人体真皮，并天然富含NGF,HGF,KGF,bFGF,TGF．Dl和EGF等多种促细胞增殖生长的活性因子，能作为良好载体扩增成纤维细胞和表皮细胞等多种细胞，促进细胞增殖并能维持细胞干性，且移植于小鼠创面后细胞能长期存活并参与小鼠新生表皮的形成15l'59捌】。在本研究中，我们直接加工人新鲜羊膜为微粒羊膜，完整保留了羊膜上皮细胞生长的天然微环境，能促进羊膜上皮细胞移植后在创面存活。2．相比于大张羊膜，微粒化形式羊膜更有利于羊膜上皮细胞在创面的存活。羊膜质软、较薄且机械强度很低，大张羊膜应用于创面时很难保证羊膜完全平整粘附到创面，羊膜很容易变干而与创面分离。在本研究中，我们采用微粒化形式羊膜修复创面，创面血浆很容易渗透到微粒羊膜间隙为羊膜上皮细胞生长提供必需的营养物质，保证羊膜上皮细胞在创面存活良好。干细胞具有自我增殖且多向分化能力，故致瘤性是干细胞临床应用时巨大的安全隐患，．69．万方数据 第二军医大学博士学位论文为干细胞临床应用中的又一瓶颈问题。以往文献将人羊膜细胞应用于动物实验及临床实验后未见致瘤性的报道【1”】，羊膜来源细胞一直被认为是一种安全可靠无致瘤性的干细胞而受到再生医学研究者青睐。本研究中我们将微粒羊膜应用于创面后，早期羊膜上皮细胞在创面存活良好并出现复层生长的趋势，但同时TUNEL染色发现移植后第7天创面少数羊膜上皮细胞出现凋亡，移植后第28天免疫组化染色追踪创面人羊膜上皮细胞发现未见染色阳性人羊膜上皮细胞，提示移植后羊膜上皮细胞可在创面逐渐凋亡最后从创面完全消失。Miki报道人羊膜上皮细胞缺乏端粒酶，在体外扩增能力有限，这可能部分解释本研究中羊膜上皮细胞最终从创面消失143；1161。随后，我们探讨活性微粒羊膜移植修复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及相关机制，发现移植后第14天，冻存活性微粒羊膜组创面愈合率明显高于冻存去细胞微粒羊膜组及空白对照组，且随时间推移三组之间创面愈合率的差距不断加大。多项研究己阐述采用甘油等方法保存的羊膜可通过加速上皮化、减轻炎症反应、抑制瘢痕形成和抗菌等作用促进创面愈合【15‘17】，而目前临床使用最多的冷冻干燥羊膜主要通过释放多种生长因子促进成纤维细胞和间充质干细胞增殖迁移134|，增加内皮细胞增殖迁移，并能募集CD34阳性造血祖细胞至创面促进创面愈合【35；36]。但采用冷冻干燥法保存的EpiFix等羊膜产品完全丧失了羊膜上皮细胞的细胞活性，而采用甘油或者DMSO保存的羊膜虽部分保存了羊膜上皮细胞的活性，但活性仍很低，最高约40％左右，当以大张羊膜形式应用于创面后由于无法与创面粘附良好，羊膜上皮细胞失去创面血浆营养供应而导致活性可能更低。本研究中我们首次将新鲜羊膜加工为300．600微米大小微粒羊膜并用商品化冻存液STEM—CELLBANKER¨Ⅵ进行冻存，发现复苏后羊膜上皮细胞活性保存良好，可达73．08％士2．95％，随后移植冻存活性微粒羊膜修复糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面，发现羊膜上皮细胞在创面存活良好且呈复层生长的趋势。由于本研究中羊膜上皮细胞能在创面存活良好并根据前文讨论羊膜上皮细胞在慢性创面修复中的巨大潜能，故我们不能采用以前研究者得出的机制来解释本实验中活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用。以下我们将从活性微粒羊膜对糖尿病创面炎症的调控、对创面新生血管化的作用及羊膜基质作为真皮替代物重构真皮等几个方面探讨冻存活性微粒羊膜促进糖尿病创面愈合的机制。正常的炎症反应在创面愈合中发挥着重要作用，能控制创面感染、清除创面坏死组织及分泌多种生长因子促进细胞的迁移增殖【11。71。损伤发生后首先进入创面的炎症细胞为中性粒细胞，损伤组织周围血管内皮细胞高表达粘附分子，促使循环外周血中中性粒细胞穿过破损毛细血管或经过血管内皮细胞间隙进入创面ll¨。中性．．70．．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究粒细胞在早期的感染控制，坏死组织的清除中发挥着重要作用，且能分泌多种生长因子促进细胞的迁移增值【117J。数天后创面炎症细胞主要为巨噬细胞，在早期的创面修复过程中，巨噬细胞主要表现为促炎表型(Ml型巨噬细胞)，通过吞噬作用吞噬细菌并能清除创面坏死组织及凋亡中性粒细胞。随后创面炎症反应逐渐减退，促炎M1型巨噬细胞逐渐转化为抗炎M2型巨噬细胞，创面修复进入增殖期¨¨J。但在糖尿病创面中炎症反应失调，糖尿病创面早期炎症反应延迟而不能引起创面急性炎症反应，而在后期炎症细胞长时间聚集于创面引起创面慢性炎症反应111=81；119]。不仅如此，糖尿病创面M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞数量的比值显著高于正常创面皮肤，M1型巨噬细胞能持续性分泌IL．1，IL一6，TNF．0【等炎症因子加重创面炎症反应，并以正反馈形式作用于创面炎症细胞，继续增加创面M1型巨噬细胞数目及炎症因子的释放。同时M1型巨噬细胞能持续性分泌包括基质金属蛋白酶在内的多种蛋白酶，使创面蛋白酶和蛋白酶抑制剂平衡被打破，降解细胞外基质延迟慢性创面真皮重构过程172-74；挖o】。基于此，早期趋化炎症细胞进入创面引发创面急性炎症反应或者促进巨噬细胞从促炎M1型巨噬细胞向抑炎M2型巨噬细胞表型转化均为促进糖尿病创面愈合的有效方式。Wood等在创面早期创周局部注射巨噬细胞趋化因子CCL2引发糖尿病创面早期炎症反应，发现创面第5天巨噬细胞数目明显增加，而第10天时创面炎症反应及时消退，此过程类似于正常创面愈合时的炎症反应过程，从而能显著促进糖尿病创面愈合【1191。Mirza等发现糖尿病创面炎症环境能诱导增加创面M1型巨噬细胞数量，而增加的M1型巨噬细胞能分泌更多的炎症因子导致正反馈形成，使糖尿病创面出现延长且高水平慢性炎症反应。进一步体内外实验采用IL．1抗体阻断IL一1作用后创面巨噬细胞能从M1型向M2型转化，能减轻创面促炎因子释放而增加创面愈合相关因子表达，从而能显著促进糖尿病小鼠创面愈合【74】。Leal等采用神经肽P物质局部注射于糖尿病创面后，发现P物质可引发糖尿病创面急性炎症反应过程且能促进创面M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，从而显著促进糖尿病创面愈合过程【l201。人羊膜上皮细胞在炎症调控中的作用已有较多报道，尾静脉注射人羊膜上皮细胞能明显抑制博来霉素诱导的巨噬细胞迁移、促进巨噬细胞从M1型向M2型巨噬细胞转化，进而下调肺局部促炎因子MCP．1、TNF．0l、IL一1和IL．6的表达而减轻肺纤维化【4￡471。在四氯化碳诱导的肝纤维化模型中，羊膜上皮细胞降低肝内巨噬细胞浸润并促进巨噬细胞向M2型转化，从而减轻肝纤维化1121J。不仅如此，在脊髓损伤模型和脑损伤模型中也发现羊膜上皮细胞能抑制巨噬细胞迁移，减轻损伤区炎症反应从而改善损伤预后【122‘124】。尽管大部分文献支持羊膜上皮细胞调控炎症反应主要是通过抑制巨噬细胞迁移并促进巨噬细胞从M1型向M2型转化发挥作用，Uberti等却得出相反的结论，证明羊膜上皮细胞万方数据 第二军医大学博士学位论文浸提液能促进巨噬细胞迁移并增加其吞噬细菌的能力[125]。在本研究中我们发现移植活性微粒羊膜至创面能早期增加巨噬细胞募集至创面引发糖尿病创面急性炎症反应，在创面中后期活性微粒羊膜组巨噬细胞急剧减少，其炎症反应过程恢复至类似于急性创面炎症过程；同时活性微粒羊膜也能促进糖尿病创面巨噬细胞从M1型向M2型表型转化，并伴随创面促炎因子IL．1B，TNF一0【，IL一6表达降低及促创面愈合相关因子VEGF，IGF一1，TGF．B1的表达增高，从而为创面愈合提供合适的微环境。动物实验证实活性微粒羊膜组创面愈合率明显快于去细胞微粒羊膜组，而两组之间的主要区别在于活性微粒羊膜组含活性羊膜上皮细胞，且移植后能在创面后能长时间存活，提示活性羊膜上皮细胞在创面愈合中发挥着重要作用。免疫组化追踪羊膜上皮细胞转归时我们发现染色阳性的羊膜上皮细胞均匀环绕于羊膜基质周围并与羊膜基质紧密粘附，仅非常少量羊膜上皮细胞迁移离开羊膜基质，提示活性羊膜微粒中羊膜上皮细胞可能主要通过旁分泌作用而不是转分化作用来促进创面愈合。为验证我们的假设，我们进一步采用体外实验探究活性微粒羊膜条件培养基对巨噬细胞功能的影响，发现活性微粒羊膜条件培养基能促进巨噬细胞迁移及表型转化，而对巨噬细胞增殖无影响。本研究第一部分我们采用RayBio人趋化因子及炎症因子抗体芯片检测活性微粒羊膜浸提液中38种趋化因子及39种炎症因子的表达，发现其高表达GRO，MCP一1，andMIP—lb等因子，而这些因子已被验证具有促进炎症细胞迁移的功能9；126；1271，这可能部分解释活性微粒羊膜条件培养基能促进巨噬细胞迁移的原因。目前文献报道巨噬细胞从M1型向M2型极化主要通过IL．4，IL．13，IL—10等细胞因子的作用【128；129]，但本研究中我们未通过抗体芯片检测到这些因子在活性微粒羊膜条件培养基中高表达，故我们尚不能对活性羊膜微粒促进巨噬细胞极化的机制作出合理推测，未来我们需要进一步研究来阐明其具体机制。创面血管新生能为愈合过程中各细胞提供营养成分并带走代谢废物，主要通过局部干细胞血管发生(vasculogenesis)和新生血管形成(angiogenesis)这两种形式形成。干细胞血管发生指损伤发生后内皮祖细胞能从骨髓动员至外周血最后趋化至创面分化为内皮细胞，参与新生血管的形成，同时能分泌VEGF等生长因子促进内皮细胞迁移增殖【75；176】；而局部新生血管形成指创周血管的血管内皮细胞在各生长因子的刺激下，能增殖迁移最后出芽形成新的血管。在糖尿病患者中，新生血管的两个过程均发生障碍导致糖尿病创面新生血管延迟减少而影响创面愈合177。78；130]。Marrotte等发现糖尿病小鼠内皮祖细胞低表达锰超氧化物歧化酶，抑制其迁移及成管能力，尾静脉注射锰超氧化物歧化酶基因修饰后的内皮祖细胞能显著提高其向创面归巢能力及成血管能力，进而促进创面新生血管化加速糖尿病创面愈厶I川J。Liu等发现硫化氢能修复糖尿病小鼠EPCs功能受损并增加其体外成小管能力，体内硫一72．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究氢化钠治疗能增加糖尿病创面EPCs及新生血管数目，从而促进创面愈合【l醒J。Jihyun等采用P物质局部注射治疗糖尿病创面，发现外周血中EPCs数目增多而促进创面血管新生加速慢性创面愈合【133】。以上研究均提示动员糖尿病小鼠骨髓EPCs或增强EPCs功能均能促进糖尿病创面新生血管化而加速创面愈合。羊膜在血管化方面的作用目前存在争议，临床将羊膜用于眼科角膜损伤等治疗主要依赖于羊膜抗血管生成及抗炎的作用机制，且羊膜上皮细胞、间充质细胞及羊膜基质层均发现表达TIMPl、TIMP2、TIMP3、TIMP4等因子也为羊膜具有抑制血管生成及抗炎作用提供了理论依据【134；1351。但亦有文献支持羊膜促进血管新生的作用。去细胞羊膜产品EpiFix能促进内皮细胞增殖迁移，增加移植部位血管密度，并能募集CD34阳性造血祖细胞至创面促进创面愈合【35'36J：体外活性羊膜及羊膜细胞也能分泌IGFBP-6，MCSF—R，PDGF．AB，FGF．6和VEGF．R3等多种因子促进人脐静脉内皮细胞增殖迁移及成管能力【50J；Wolbank等也报道羊膜浸提液能高表达angiogenin．，GRO，IL．6／8等促血管生成因子【136】。羊膜在血管化中的不同作用目前原因不清，Zhu等通过不同的动物模型解释可能由于不同的炎症环境因素造成，人羊膜上皮细胞能减少博来霉素诱导肺纤维化模型中肺局部血管密度但增加高氧诱导肺损伤模型中肺局部血管数【1371。在本研究中我们首次探讨活性微粒羊膜在糖尿病创面新生血管化中的作用。移植冻存活性微粒羊膜至创面5天后活性微粒羊膜组外周血中EPCs数目明显增加，CD34阳性造血祖细胞数量在活性微粒羊膜组创面也明显多于其他两组，且靠近活性微粒羊膜处可见CD34阳性细胞形成微血管结构，这些结果提示活性微粒羊膜能动员骨髓EPCs及造血祖细胞至外周血并归巢至创面参与新生血管的形成，进而促进糖尿病创面愈合。进一步肉眼大体观及免疫组化检测创面新生血管数目也均显示活性微粒羊膜组新生血管化明显快于其他两组。前面讨论我们提出活性微粒羊膜中羊膜上皮细胞可能主要通过旁分泌作用而非转分化作用来促进创面愈合，为此我们收集活性微粒羊膜条件培养基并通过体外实验探究其对血管内皮细胞功能的影响，发现活性微粒羊膜条件培养基能促进血管内皮细胞增殖、迁移及体外成小管能力，提示活性微粒羊膜能通过旁分泌机制促进局部新生血管形成。本研究第一部分我们采用RayBio人生长因子、趋化因子及炎症因子抗体芯片检测活性微粒羊膜条件培养基中41种生长因子、38种趋化因子及39种炎症因子的表达，发现其高表达IL一6，IL．8，TGF．Bl及HGF等因子，而这些因子己被前人文献证实具有促进血管内皮细胞增殖、迁移及粘附生长功能【138‘1401，这可能部分解释活性微粒羊膜条件培养基能促进血管新生的原因。本部分实验结果提示活性微粒羊膜能从干细胞血管发生和新生血管形成两方面促进糖尿病创面血管形成，抗体芯片对筛选促血管新生的旁分泌因子有重要提示作用，但本研究仍未证实促血管化作用的关键因子，需今后进一步研-73．万方数据 第二军医大学博士学位论文究来探讨其具体机制。羊膜基质成分类似于人体真皮，推测羊膜基质能作为真皮替代物重构真皮。多篇文献己显示羊膜基质在组织工程皮肤中巨大的应用潜能，不仅能单独作为真皮支架修复创面，也能作为天然载体提供合适微环境促进表皮细胞和成纤维细胞粘附、增殖和分化，构建的组织工程皮肤能在创面存活良好，创面愈合后与正常皮肤结构类似～04]。但羊膜质软、较薄且机械强度很低，临床以大张羊膜形式应用于创面时很难保证羊膜完全平整粘附到创面，羊膜很容易变干而与创面分离，仅作为临时敷料短时间覆盖创面。在本研究中，我们将大张新鲜羊膜加工为微粒羊膜，不仅保证羊膜与创面粘附良好，创面血浆能提供营养促进微粒羊膜中羊膜上皮细胞存活，而且微粒羊膜临床操作更加方便快捷。应用时我们采用吸管或者20ml注射器将微粒羊膜直接均匀涂抹到创面即可，而避免了大张羊膜使用过程中需要根据创面大小和形状将羊膜进行裁剪的过程，特别是对于不规则创面及较深的创面，使用微粒化羊膜优势明显。活性微粒羊膜表现出良好的组织相容性，移植后未出现皮肤红斑、坏死及其他免疫排斥症状，且创面早期微粒羊膜周围成纤维细胞侵入生长及血管化明显。移植后35天HE染色可见羊膜微粒充填于真皮基质被完全上皮化的表皮覆盖，真皮层厚度明显高于空白对照组，移植后60天真皮层微粒羊膜大部分降解。由此可见活性微粒羊膜能作为良好的真皮替代物促进创面真皮重构并适时降解，其表现出良好的组织相容性，临床使用时方便快捷，能提高羊膜临床应用潜能。最后，创面形成后成纤维细胞迁移增殖并分泌细胞外基质重构真皮及表皮细胞从创周增殖爬行、逐渐上皮化封闭创面在创面愈合中发挥着关键性作用。但在糖尿病创面等慢性创面中，成纤维细胞与表皮细胞在高糖及高炎症等微环境下出现各种功能障碍，表现为增殖迁移减慢、衰老加速及各细胞信号通路改变导致对生长因子刺激不敏感等【68；69；14卜144]。人羊膜上皮细胞浸提液表达PDGF、VEGF、angiogenin、TGF．B2等多种活性因子，促进表皮细胞及成纤维细胞增殖、迁移，创面局部注射能促进急慢性创面愈合，增加上皮化，加速真皮重构【2l；48；49]，提示人羊膜上皮细胞可通过调控表皮细胞及成纤维细胞功能而在创面愈合中发挥促进作用。Zhao等进一步探究其机制，发现羊膜上皮细胞能上调ERK，JNK和AKT信号通路增加表皮细胞增殖迁移【1451。iin等的报道也通过小鼠体内实验证实羊膜上皮细胞能分化为表皮细胞，促进创面上皮化加速创面愈合【52】。到目前为止羊膜上皮细胞在慢性创面中的作用及其机制未见文献报道。本研究中我们通过体内实验发现冻存活性微粒羊膜能促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，体外实验发现活性微粒羊膜条件培养基能显著促进高糖环境下人原代成纤维细胞和表皮细胞的增值迁移，证明活性微粒羊膜可通过旁分泌作用调控成纤维细胞及表皮细胞功能，进而促进糖尿病创面愈合。本．．74．．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿痛创面愈合的作用及机制研究研究第一部分我们采用RayBio抗体芯片检测活性微粒羊膜条件培养基中生长因子、趋化因子及炎症因子的表达，发现CSF2，CSF3，HB—EGF和TGF—Bl等因子呈现高表达，而这些因子已被以前文献证实具有促进表皮细胞和成纤维细胞增殖、迁移的作用，这可能部分解释活性微粒羊膜条件培养基能调控表皮细胞和成纤维细胞功能的原因。综上所述，本研究发现冻存活性微粒羊膜能明显促进糖尿病小鼠创面愈合，移植后羊膜上皮细胞能在创面存活良好并适时凋亡，无致瘤性风险。冻存活性微粒羊膜主要通过旁分泌作用调控创面炎症反应，招募干细胞、促进新生血管化从而促进糖尿病创面愈合，且羊膜基质具有良好的组织相容性，能长时间作为真皮替代物存在于创面帮助真皮重构并适时降解，无免疫排斥等现象。本研究制备的冻存活性微粒羊膜能调控糖尿病创面愈合过程中炎症反应、血管化、真皮重构及上皮化等多个环节，改善创面由细胞、细胞因子及细胞外基质形成的网络化微环境，有望为临床提供一种安全有效、使用方便且价格便宜的天然活性真皮替代物，能最大限度的扩大羊膜临床应用潜能。．75．万方数据 第二军医大学博士学位论文综述匀K】尘人羊膜在治疗慢性创面中的研究进展正常创面愈合可大概分为4个渐进而又部分重叠的过程，即止血、炎症、增殖和重塑[101。愈合过程需合适的修复微环境，即表达各种生长因子、炎症因子、趋化因子和可溶性介质促进细胞间信号转导以及可控水平的蛋白酶的表达，促使炎症细胞、表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞间相互作用形成肉芽组织最后上皮化封闭创面【146】。目前慢性创面的定义为持续三个月以上的难愈性创面191，主要可分为糖尿病溃疡、静脉型溃疡、外周动脉病变导致的溃疡或者压疮最后形成慢性创面。无论是何种原因导致的慢性创面，其共同特征为上述的正常创面修复微环境受损，表现为持续性慢性炎症、细胞衰老、创面生长因子缺乏、微生物过量负荷及创面蛋白酶失控性过表达等，这些因素最终导致创面血管化障碍、肉芽组织形成不良及上皮化缓慢而形成慢性难愈性创面【1471。除常规的清创、创面敷料覆盖保湿、创面感染控制和创面减压治疗外，越来越多的辅助治疗方案也不断在临床使用且取得了一定的疗效，主要包括细胞因子治疗、活性皮肤替代物治疗、负压治疗、电刺激以及最近的商品化羊膜产品等。本文就目前临床使用的羊膜产品在慢性创面中的作用及相关机制进行综述。1．羊膜的结构人羊膜来源于废弃的胎盘组织，是胎盘的最内层，厚约O．22毫米至0．5毫米不等，为无神经、血管及淋巴的半透明膜，可分为五层：上皮层，基底膜层，致密层，成纤维细胞层及海绵层【1481。羊膜上皮层为羊膜最内层，面向羊水，主要是单层立方上皮，含脂质包体和有胞饮作用的囊泡，并在细胞的顶面含有微绒毛结构而基底面含足突状结构【149]；海绵层为羊膜最外层，与血管化的绒毛膜相连。羊膜的基底膜层是人体最厚的基底膜，与皮肤及角膜的基底膜结构类似，不仅包含由周围细胞分泌和组装而成的大分子复杂网络结构，且含有多种生长因子和可溶性分子。多种胶原蛋白(I型、III型、IV型、VII型、XV型、XVI型、XVII型及XVIII型)，层粘连蛋白(et3，131，D2，133，'y1和72链)，纤维连接蛋白，基底膜聚糖，聚集蛋白，巢蛋白构成人羊膜基底膜细胞外基质的主要成分【150。152J。而致密层，成纤维细胞层一起构成的羊膜基质层主要含有I型，IV型，VII型胶原，弹性蛋白和糖胺聚糖等成分，其结构类似于人体真皮。．76．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究2．羊膜在慢性创面治疗中的临床应用新鲜羊膜由于无法长期保存，故不适用于临床常规使用。目前临床使用的羊膜产品均经过冷冻保存或者脱水加工处理，能长期保存且即时可用。大部分已发表的临床数据来源于脱水羊膜在慢性创面中的应用，最常见的为美国MiMedxGroup公司的羊膜产品EpiFix和AmnioFix。健康产妇签署知情同意书后，挑选HIV，HBV，HCV和梅毒等血清学检查均为阴性的剖腹产产妇胎盘，经过MiMedxGroup公司自主研发的PURION方法处理后清除羊膜表面血迹及微生物，并脱水长期保存，最多能室温保持5年左右。PURION方法不仅能比较完好的保存羊膜结构，且能保存多种羊膜固有生长因子，但脱水处理后羊膜不含活细胞。早期商品化羊膜在临床应用修复慢性创面的作用主要是以病例系列报告或者个案报告的形式报道。3例足部神经性病变的难愈渍疡创面患者经过清创及常规敷料治疗4周后，创面愈合率小于50％，随后Shah等应用EpiFix治疗患者创面，发现临床疗效确切，慢性创面数周内完全愈合【153】。另一项病例系列报道4例难愈性糖尿病足部溃疡患者经过标准化治疗及负压等治疗后仍无明显改善，但使用EpiFix治疗1．3次后创面痊愈且长期随访未见复发，从而避免了患者行皮瓣手术【1541。进一步比较有说服力的数据来源于一项前瞻性单中心的随机对照临床试验，纳入的患者为难愈性糖尿病足部溃疡持续4周以上无愈合趋势，且创面无感染，患者足部血供良好。EpiFix组纳入13例患者而标准治疗组作为对照纳入12例患者。治疗4周后，EpiFix组总创面愈合率平均为77％而对照组为0％；6周后EpiFix组总创面愈合率平均为92％而对照组为8％，显示出EpiFix在慢性创面治疗中的有效作用【1551。另一项研究纳入ll例患者，均为糖尿病足治疗失败(治疗4周后愈合率小于50％)或迁延不愈(治疗12周仍未愈合)，平均创面时间21．1+12．4周而平均创面面积4．7土5．0cm2。EpiFix两周更换一次，4周后EpiFix组创面愈合率为87．6+16．0％而标准治疗组为26．84-45．3％l”61。除了对糖尿病足难愈创面的有效治疗作用外，在静脉性溃疡中商品化羊膜也表现出巨大的优势。一项多中心随机对照临床试验纳入84例静脉性溃疡患者随机分为脱水羊膜+多层压迫治疗组或者单纯多层压迫治疗组。治疗4周后，对照组创面愈合率平均为19．0％而脱水羊膜+多层压迫治疗组平均48．1％1157l。为了实现羊膜临床应用的标准化、流程化，有必要探究商品化羊膜产品临床使用频率对创面愈合的影响。一项前瞻性的随机对照临床试验纳入40例难愈性糖尿病足溃疡患者，分为两组：标准治疗+每周更换EpiFix一次或者标准治疗+每两周更换EpiFix一次。治疗12周后92．5％的难愈性溃疡创面I临床痊愈，每两周更换EpiFix一次的患者愈合时间为4．14-2．9周，而每周更换EpiFix一次愈合时间明显缩短(2．44-1．8周)。故临床推荐每周更换EpiFix一次直至创面痊愈，能缩短患者创面愈合时-77—万方数据 第二军医大学博士学位论文间，减少住院天数和住院费用，具有更强的经济优势【181。除标准化治疗外，目前临床也常采用组织工程皮肤作为辅助治疗方案，将商品化羊膜产品与组织工程皮肤进行临床有效性及经济效应对比有利于临床医生进行临床决策。Zelen等纳入100例难愈性糖尿病足溃疡患者随机分为三组：组织工程皮肤产品Apligraf组(33例)，EpiFix(32例)及标准化治疗组(35例)，发现12周内Apligraf组73％患者获得创面痊愈，标准治疗组51％患者获得创面痊愈而EpiFix组这一数值可达到97％，明显高于其他两组。Apligraf组、标准治疗组及EpiFix组平均愈合时间分别为47．9天、57．4天、23．6天。同时Apligraf组平均花费为8918美金，而EpiFiX组仅需1517美金。以上结果可见EpiFix无论在治疗效果还是经济花费方面均显著优于Apligraff”8I。Kirsner等通过回顾性分析2014年美国99个创伤中心218例采用组织工程皮肤或者羊膜产品治疗慢性难愈性创面患者，得出了不一样的结论，发现采用组织工程皮肤产品治疗组平均愈合时间为13．3周，远低于羊膜治疗组26周的平均愈合时间【l”】。上述报道结果不一样的原因很多，可能由于分别为前瞻性研究和回顾性研究，未来需要更多大样本多中心临床随机对照试验来探讨慢性创面不同辅助方法的治疗有效性及经济消耗。3．羊膜促进慢性创面修复的作用机制尽管目前脱水羊膜促进慢性创面愈合机制未完全阐明，但公认羊膜负载的固有生长因子在其中起着非常重要的作用。ELISA检测EpiFix浸提液，发现其表达PDGF．AA、PDGF．BB、TGF．Q、TGF．131、bFGF、EGF、PLGF、G—CSF等多种活性因子，在促进创面表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等多种细胞的增值迁移中发挥着重要作用。同时EpiFix浸提液也能表达IL一4，IL一6，IL．8，IL—10和TIMP一1，TIMP．2，TIMP．4等因子，有可能抑制慢性创面过度炎症反应及金属蛋白酶的表达，进而促进慢性创面愈合。体外实验证明EpiFix浸提液能促进成纤维细胞及间充质干细胞的迁移增殖，进一步体内实验也发现EpiFix能招募更多间充质干细胞至创面参与创面修复【341。经过PURION方法处理后，组织学染色发现羊膜形态结构完整，羊膜基质层胶原蛋白、蛋白多糖和弹性纤维的排列与新鲜羊膜类似，且具有热稳定性，在温度一78．70C至73．5。C之间羊膜均能完整保存其抗张强度。随后ELISA检测36种与创面愈合及炎症调控相关因子，发现PURION方法处理后羊膜生物学活性保存良好，能促进成纤维细胞增殖并使其上调bFGF、PLGF、G—CSF等因子表达060]。除对成纤维细胞作用外，脱水羊膜对多种干细胞也能产生调控作用。羊膜可溶性提取物能体外促进骨髓来源间充质干细胞、脂肪来源干细胞及造血干细胞增殖迁移，并影响这些干细胞旁分泌功能【1611。进一步体内实验验证这一结论，将脱水羊膜产品皮下移植后能动员归巢CD34阳性造血祖细胞至创面参与新生血管化，这一作用．78．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机杀4研究可能与脱水羊膜表达SDF．1有关【361。新生血管化障碍为慢性创面难愈的重要机制，Koob等发现脱水羊膜能表达EGF、bFGF、HB．EGF、angiogenin、HGF、PDGF—BB、VEGF等多种促血管生成生长因子，并在体外实验中促进人微血管内皮细胞增殖迁移。不仅如此，脱水羊膜还能上调微血管内皮细胞GM—CSF、TGF—B3和HB—EGF等30多种与促血管生成相关因子的表达，形成促血管生成的正反馈作用，进一步体内实验也证实小鼠皮下移植脱水羊膜能促进血管生成【35】。但须强调的是和单层羊膜相比，同时含羊膜及绒毛膜的产品细胞因子的表达要明显增高，为单层羊膜的4-5倍，提示多层羊膜可能产生更好的临床疗效【l621。4．人羊膜上皮细胞在创面愈合中的作用羊膜上皮细胞层为羊膜最内层，具有干细胞特征，能表达OCT-4，nanog，SEA·3等多种胚胎干细胞标志物，并拥有向三个胚层细胞分化的能力而成为再生医学的种子细胞㈤431。同时，人羊膜上皮细胞具有免疫豁免及免疫调节功能，其不表达人类白细胞抗原A、B、C、DR，具有极低的免疫源性。将羊膜进行角膜移植和肾包膜下移植后，未见排异反应，移植处无明显炎症细胞浸润㈣。多篇文献报道人羊膜上皮细胞在炎症调控上显示出巨大潜能，尾静脉注射人羊膜上皮细胞能抑制巨噬细胞迁移并促进巨噬细胞从M1型向M2型巨噬细胞转化，减轻组织局部炎症反应，在肝纤维化及肺纤维化模型中均证实羊膜上皮细胞能通过调控炎症反应减轻四氯化碳诱导的肝纤维化及博来霉素诱导的肺纤维化‘45；47；1211。羊膜上皮细胞在创面修复中的作用目前研究较少，且主要集中在对急性创面的修复上，未见将羊膜上皮细胞直接应用于慢性创面的报道。人羊膜上皮细胞浸提液能表达PDGF、VEGF、angiogenin、TGF．B2、TIMP一1及TIMP。2等多种活性因子，促进表皮细胞及成纤维细胞增殖、迁移，创面局部注射治疗小鼠急慢性创面，发现其能显著促进创面愈合，增加上皮化，加速真皮重构[2k48；491。人新鲜羊膜及羊膜细胞能分泌IGFBP．6，PDGF．AB，FGF．6，IGFBP一4，NT一4，和VEGF—R3等多种生长因子，在体外促进人脐静脉内皮细胞迁移及成管能力【501，推测人羊膜上皮细胞可能在血管新生中也能发挥作用。首次直接将人羊膜上皮细胞应用于创面治疗的证据来源于2015年jin等人的报道，局部注射人羊膜上皮细胞至小鼠全层皮肤缺损创面后发现细胞能长时间存活于创面，一方面能分化为表皮细胞，另一方面能旁分泌EGF，PDGF．B和IL．8等因子促进创面上皮化加速创面愈合【521。Zhao等进一步探究其机制，发现羊膜上皮细胞能通过上调ERK、JNK和AKT等信号通路增加表皮细胞增殖迁移【1451。慢性创面以创面慢性炎症反应、新生血管障碍、上皮化减慢和成纤维细胞功能受抑制等为表现，目前已报道的文献显示羊膜上皮细胞对上述环节均能产生调控作用，由此我们推测羊膜上皮细胞可能在慢性创面治疗中亦能发挥治疗潜能，但具体结论需．-79．万方数据 第二军医大学博士学位论文进一步体内外实验来验证。5．前景与挑战目前商品化的羊膜产品多将羊膜进行脱水处理后能比较完整保存羊膜结构及多种固有生长因子成分，在己完成的临床试验中均显示出对慢性创面较好的临床疗效。羊膜来源广泛，无免疫排斥及伦理学争议，脱水羊膜能在室温长期保存，能有效避免疾病传播且临床即时可用，为慢性创面较为理想天然敷料。但目前针对商品化羊膜产品在慢性创面中治疗作用所进行的临床试验样本量偏小，多为单中心数据，未来需更多的多中心、大样本的随机对照临床试验来进一步肯定并推广羊膜产品对慢性创面的治疗作用。其次目前临床商品化羊膜产品不含羊膜活性细胞成分，无法将羊膜临床应用潜能发挥到最大化。羊膜上皮细胞的多向分化潜能、免疫调控功能及旁分泌作用均显示出其在创面愈合中的巨大潜能，但目前对其在创面愈合中的作用及机制研究仍非常少，在慢性创面治疗中的作用目前仍属空白。探讨羊膜上皮细胞在创面愈合中的作用及其机制、寻找更理想的羊膜保存方法更好保留羊膜活性细胞为今后羊膜研究的方向。综上所述，羊膜在创面愈合中显示出巨大的临床应用潜能，如何更好的保存羊膜活性并探讨羊膜上皮细胞在创面愈合中的作用及其机制为未来研究的方向。．80．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究参考文献[1]WhitingDRGuariguataL，W色ilC，eta1．IDFdiabetesatlas：globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor2011and2030[J]．DiabetesResClinPract，2011，94(3)：311-21．[2]FederationID．E-Atlasofdiabetes．5thed．2015[J]．http：／／www．idf．org／diabetesatlas．【3】BoultonAJ，ArmstrongDGAlbertSF，eta1．Comprehensivefootexaminationandriskassessment．AreportoftheTaskForceoftheFootCareInterestGroupoftheAmericanDiabetesAssociation，withendorsementbytheAmericanAssociationofClinicalEndocrinologists[J]．PhysTher,2008，8801)：1436-43．【4]4BoultonAJM．TheDiabeticFootPreface[J]．MedicalClinicsOfNorthAmerica,2013，97(5)：Xiii．XiV．【5】SnyderRJ，KirsnerRS，WarrinerRA，3rd，eta1．Consensusrecommendationsonadvancingthestandardofcareforbeatingneuropathicfootulcersinpatientswithdiabetes[J]．OstomyWoundManage，2010，56(4Suppl)：SI-24．【6】BoultonAJ，VileikyteL，Ragnarson—TennvallGeta1．Theglobalburdenofdiabeticfootdisease[J]．Lancet，2005，366(9498)：1719-24．[7】O’loughlinA，McintoshC，DinneenSF，eta1．Reviewpaper：basicconceptstonoveltherapies：areviewofthediabeticfoot[J]．hltJLowExtremWounds，2010，9(2)：90—102．[8]DargisVPantelejevaO，JonushalteA，eta1．BenefitsofamultidisciplinaryapproachinthemanagementofrecurrentdiabeticfootulcerationinLithuania：aprospectivestudy[J]．DiabetesCare，1999，22(9)：1428-31．[9】WerdinF，TenenhausM，RennekampffHO．Chronicwoundcare[J]．Lancet，2008，372(9653)：1860—2．【10]GurtnerGC，WemerS，BarrandonYeta1．Woundrepairandregeneration[J]．Nature，2008，453(7193)：314-21．【11】Falangav．WoundhealinganditsimpairmentinthediabeticfootIJ]．LanceL2005，366(9498)：1736-43．【12】FrykbergRGZgonisT，ArmstrongDGeta1．Diabeticfootdisorders．Aclinicalpracticeguideline(2006revision)[J]．JFootAnkleSurg，2006，45(5Suppl)：S1-66．【13】RiauAK，BeuermanRW，LiraLS，eta1．Preservation，sterilizationandde-epithelializationofhumanamnioticmembraneforuseinocularsurfacereconstruction[J]．Biomaterials，2010，31(2)：216．25—81．万方数据 第二军医大学博士学位论文【14】JD．Skintransplantationwithareviewof550casesattheJohnsHopkinsHospital[J]．JohnsHopkinsMedJ，1910，15：307-396．【15】GrussJS，JirschDW．Humanamnioticmembrane：aversatilewounddressing[J]．CanMedAssocJ，1978，118(10)：1237·46．[16]BennettJEMatthewsR，FaulkWETreatmentofchroniculcerationofthelegswithhumanarnnion[J]．Lancet,1980，1(8179)：1153-6．[17】JohnT．Humanamnioticmembranetransplantation：past，present，andfuture[J]．OphthalmolClinNorthAm，2003，16(1)：43—65，vi．[18】ZelenCM，SerenaTE，SnyderRJ．Aprospective，randomisedcomparativestudyofweeklyversusbiweeklyapplicationofdehydratedhumanamnion／chorionmembraneallograftinthemanagementofdiabeticfootulcers[J]．IntWoundJ，2014，11(2)：122—8．[19]ZelenCM，GouldL，SerenaTE，eta1．Aprospective，randomised，controlled，multi-centrecomparmiveeffectivenessstudyofhealingusingdehydratedhumanamnion／chorionmembraneallograft，bioengineeredskinsubstituteorstandardofcarefortreatmentofchroniclowerextremitydiabeticulcers[J]．IntWoundJ，2015，12(6)：724-32．[20】FranzMGPayneWGXingL，eta1．Theuseofamnion-derivedcellularcytokinesolutiontoimprovehealinginacuteandchronicwoundmodels[J]．Eplasty,2008．8：e21．[21】BergmannJ，HacklF，KoyamaT，eta1．Theeffectofamnion-derivedcellularcytokinesolutionontheepithelializationofpartial-thicknessdonorsitewoundsinnormalandstreptozotocin·-induceddiabeticswine[J]．Eplasty,2009．9：e49．【22]FaulkW只MatthewsKStevensPJ，eta1．Humanamnionasanadjunctinwoundhealing[J]．Lancet，1980，1(8179)：1156-8．[23]SawhneyCP．AmnioticmembraneaSabiologicaldressinginthemanagementofbums[J]．Burns，1989，15(5)：339-42．[24】QuinbyWC，Jr．，HooverHC，ScheflanM，eta1．Clinicaltrialsofamnioticmembranesinbumwoundcare[J]．PlastRecons仃Surg,1982，70(6)：711-17．【25】RamakrishnanKM，JayaramanVManagementofpartial-thicknessburnwoundsbyamnioticmembrane：acost-effectivetreatmentindevelopingcountries[J]．Burns，1997，23Suppl1：$33-6．【26】MaralT，BormanH，ArslanH，eta1．Effectivenessofhumanamnionpreservedlong-terminglycerolasatemporarybiologicaldressing[J]．Bums，1999，25(7)：625-35．【27】RavishankerRBathAS，RoyR．”AmnionBank"--theuseoflongtermglycerolpreservedamnioticmembranesinthemanagementofsuperficialandsuperficialpartialthicknessbums[J]．．82—万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究Burus，2003，29(4)：369-74．f2s】KestingMR，WolffKD，Hohlweg—MajertB，eta1．Theroleofallogenicamnioticmembraneinbumtreatment[J]．JBumCareRes，2009，29(6)：907一t6．【29】MohammadiAA，SeyedJafariSM，KiasatM，eta1．Effectoffreshhumanamnioticmembranedressingon酽afttakeinpmients诵也chronicbumwoundscomparedwithconventionalmethods[J]．Bums，2013，39(2)：349-53．【30】FairbaimNGRandolphMA，RedmondRW．Theclinicalapplicationsofhumanamnioninplasticsu喀ery【J】．JPlastReconstrAesthetSurg，2014，67(5)：662-75．【31】MermetI，PottierN，SainthiilierJM，eta1．Useofamnioticmembranetransplantationinthetreatmentofvenouslegulcers[J]．WoundRepairRegen，2007，15(4)：459—64．【32】WeberB，MartinE．Aprospectivestudyof20footandanklewoundstreatedwithcryopreservedamnioticmembraneandfluidallografl[J]．JFootAnkleSurg，2013，52(5)：615-21．【33】Alsina-GibertM，Pedregosa-FausteS．Amnioticmembranetransplantationinthetreatmentofchroniclowerlimbulcers[J]．ActasDermosifiliogr,2012，103(7)：608-13．[34】KoobTJ，RennertR，ZabekN，eta1．Biologicalpropertiesofdehydratedhumanamnion／chorioncomposite印m：implicationsforchronicwoundhealing[J]．IntWoundJ，2013，10(5)：493-500．[35]KoobTJ，LimJJ，MasseeM，eta1．Angiogenicpropertiesofdehydratedhumanamnion／chorionallografts：therapeuticpotentialforsofttissuerepairandregeneration[J]．VascCell，2014．6：10．[36】MaanZN，ReunertRC，KoobTJ，eta1．Cellrecruitmentbyamnionchoriongraftspromotesneovascularization[J]．JSurgRes，2015，193(2)：953-62．[37】ThomasenH，PauklinM，SteuhlKP'eta1．Comparisonofcryopreservedandair-driedhumanarnnioticmembraneforophthalmologicapplications[J]．GraefesArchClinExpOphthalmol，2009，247(12)：1691—700．【38】Rodriguez-AresMT’Lopez-ValladaresMJ，TourinoRcta1．Effectsoflyophilizationonhumanamnioticmembrane[J]．ActaOphthalmol，2009，87(4)：396-403．【39】CookeM，TanEK，MandryckyC，eta1．Comparisonofcryopreservedamnioticmembraneandumbilicalcordtissuewithdehydratedamnioticmembrane／choriontissue[J]．JWoundCare，2014，23(10)：465—74，476．[40】HennerbichlerS，ReichlB，PleinerD，eta1．TheinfluenceofvariousstorageconditionsOncellviabilityinamnioticmembrane[J]．CellTissueBank,2007，8(1)：1-8．[41]PerepelkinNM，HaywardK，MokoenaLeta1．Cryopreservedamnioticmembrane嬲．83．万方数据 第二军医大学博士学位论文transplantallografl：viabilityandpost-transplantoutcome[J]．CellTissueBank，2015．【42】NiknejadH，PeiroviH，JorjaniM，eta1．Propertiesoftheamnioticmembraneforpotentialuseintissueengineering[J]．EurCellMater,2008，15：88-99．【43】MikiT，LehmannT’CaiH，eta1．Stemcellcharacteristicsofamnioticepithelialcells[J]．StemCells，2005，23(10)：1549-59．【44】KuboM，SonodaY'MurarnatsuR，eta1．Immunogenicityofhumanamnioticmembraneinexperimentalxenotransplantation[J]．InvestOphthalmolVisSei，2001，42(7)：1539-46．【45】MoodleyY’IlancheranS，SamuelC，eta1．Humanamnionepithelialcelltransplantationabrogateslungfibrosisandaugmentsrepair[J]．AmJRespirCritCareMed，2010，182(5)：643-51．【46】MurphySVShiyunSC，TanJL，eta1．Humanamnionepithelialcellsdonotabrogatepulmonaryfibrosisinmicewithimpairedmacrophagefunction[J]．CellTransplant，2012，2l(7)：1477-92．【47】TanJL，ChanST'WallaceEM，eta1．Humanamnionepithelialcellsmediatelungrepairbydirectlymodulatingmacrophagerecruitmentandpolarization[J]．CellTransplant，2014，23(3)：319—28．【48】SteedDL，TrumpowerC，DuffyD，eta1．Amnion-derivedcellularcytokinesolution：aphysiologicalcombinationofcytokinesforwoundhealing[J]．Eplasty,2008．8：e18．【49】UbertiMGPierpontYN，KoF’eta1．Amnion—derivedcellularcytokinesolution(ACCS)promotesmigrationofkeratinocytesandfibroblasts[J]．AnnPlastSurg，2010，64(5)：632—5．【50】GrzywoezZ，Pius-SadowskaE，KlosP，eta1．Growthfactorsandtheirreceptorsderivedfromhumanamnioticcellsinvitro[J]．FoliaHistochemCytobiol，2014，52(3)：163-70．【51】JiSZ，XiaoSC，LuoPF，eta1．Anepidermalstemcellsnichemicroenvironmentcreatedbyengineeredhumananmioticmembrane[J]．Biomaterials，2011，32(31)：7801—11．[52]JinE，KimTH，HanS，eta1．Amnioticepithelialcellspromotewoundhealinginmicethroughhighepithelializationandengraftment[J]．JTissueEngRegenMed，2015．[53】ChenF，ZhangW，WuW，eta1．Cryopreservationoftissue-engineeredepithelialsheetSintrehalose[J]．Biomaterials，2011，32(33)：8426-35．[54]HolmF，StromS，InzunzaJ，eta1．Aneffectiveserum—andxeno-freechemicallydefinedfreezingprocedureforhumanembryonicandinducedpluripotentstemcells[J]．HumReprod，2010，25(5)：1271—9．[55】SaliemM，HolmF，TengzeliusRB，eta1．／mprovedcryopreservationofhumanhepatocytesusinganewxenofleecryoprotectantsolution[J]．WorldJHepatol，2012，4(5)：176-83．[56】AI-SaqiSH，SaliemM，QuezadaHC，eta1．Definedserum—andxeflo—freecryopreservation．．84．．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究ofmesenchymalstemcells[J]．CellTissueBank,2015，16(2)：181—93．[57]ShimazuT，Mori、‘TakahashiA，eta1．Serum-andxeno-freecryopreservationofhumanumbilicalcordtissueasmesenchymalstromalcellsource[J]．Cytotherapy,2015，17(5)：593—600．【58】WalkerMR，Pate／KK，StappenbeckTS．Thestemcellniche[J]．JPathol，2009，217(2)：169-80．[59]ZhangYQ，JiSZ，FangH，eta1．UseofAmnioticMicroparticlesCoatedWithFibroblastsOverexpressingSDF-1alphatoCreateanEnvironmentConducivetoNeovascularizationforRepakofFull-ThicknessSkinDefects[J]．CellTransplant,2016，25(2)：365-76．【60】HuangG，JiS，Luo只eta1．Acceleratedexpansionofepidermalkeratinocyteandimproveddermalreconstructionachievedbyengineeredamnioticmembrane[J]．CellTransplant，2013，22(10)：1831-44．[61】GrueterichM，EspanaEM，TsengSC．Exvivoexpansionoflimbalepithelialstemcells：mnnioticmembraneservingasastemcellniche[J]．SurvOphthalmol，2003，48(6)：631-46．[62】SerraM，CorreiaC，MalpiqueKeta1．Microencapsulationtechnology：apowerfultoolforintegratingexpansionandcryopreservationofhumanembryonicstemcells[J]．PLoSOne，2011，6(8)：e23212．[63】NiknejadH，DeihimT’PeiroviH，eta1．Serum—freecryopreservationofhumanamnioticepithelialcellsbeforeandafterisolationfromtheirnaturalscaffold[J]．Cryobiology,2013，67(1)：56—63．【64】ZhengYJiS，WuH，eta1．Accelerationofdiabeticwoundhealingbyacryopreservedlivingdermalsubstitutecreatedbymicronizedamnionseededwithfibroblasts[J]．AmJTranslRes，2015，7(12、：2683-93．【65】MulderGD，PaRLM，SandersL，eta1．Enhancedhealingofulcersinpatientswithdiabetesbytopicaltreatmentwithglycyl-l-histidyl·l-lysinecopper[J]．WoundRepairRegen，1994，2(4)：259—69．【66】RojasA，CavedaL，RomayC，eta1．Effectofadvancedglycosylationendproductsontheinductionofnitricoxidesynthaseinmurinemacrophages[J]．BiochemBiophysResCommun,1996，225(2)：358—62．【67]ChenSA，ChenHM，YaoYD，eta1．Topicaltreatmentwithanti-oxidantsandAunanoparticlespromotehealingofdiabeticwoundthroughreceptorforadvanceglyeationend·producB[J】．EurJPharmSci，2012，47(5)：875-83．[68]LoughlinDT，ArtlettCM．3-Deoxyglucosone·collagenaltershumandermalfibroblastmigrationandadhesion：implicationsforimpairedwoundhealinginpatientswithdiabetes[J]．Wound一85—万方数据 第二军医大学博士学位论文RepairRegen，2009，17(5)：739-49[69】Zhu只YangC，ChenLH，eta1．Impairmentofhumankeratinocytemobilityandprolifermionbyadvancedglycationendproducts-modifiedBSAIJ]．ArchDermatolRes，2011，303(5)：339．50．[70】TellecheaA，KafanasA，LealEC，eta1．Increasedskininflammationandbloodvesseldensityinhumanandexperimentaldiabetes[J]．IntJLowEx打emWounds，2013，12(1)：4-11．[711PradhanNabzdykL，KuchibhotlaS，GuthrieP’eta1．Expressionofneuropeptidesandcytokinesinarabbitmodelofdiabeticneuroischemicwoundhealing[J]．JVaseSurg，2013，58(3)：766．75e12．【72】DinhT，TecilazichF，KafanasA，eta1．Mechanismsinvolvedinthedevelopmentandhealingofdiabeticfootulceration[J]．Diabetes，2012，61(11)：2937—47．【73】OchoaO，TortesFM，ShiremanPK．Chemokinesanddiabeticwoundhealing[J]．Vascular,2007，15(6)：350-5．【74】MirzaRE，FangMM，EnnisWJ，eta1．Bloel(inginterleukin—lbetainducesahealing-associatedwoundmacrophagephenotypeandimproveshealingintype2diabetes[J]．Diabetes，2013，62(7)：2579-87．【75】BremH，Tomica2anicM．Cellularandmolecularbasisofwoundhealingindiabetes[J]．JClinInvest，2007，117(5)：1219-22．【76】FadiniGP'SartoreS，AgostiniC，eta1．Significanceofendothelialprogenitorcellsinsubjectswithdiabetes[J]．DiabetesCare，2007，30(5)：1305—13．【77】DrelaE，StankowskaI(，KulwasA，eta1．Endothelialprogenitorcellsindiabeticfootsyndrome[J]，AdvClinExpMed，2012，21(2)：249-54．【78】KimKA，ShinYJ，KimJH，eta1．Dysfunctionofendothelialprogenitorcellsunderdiabeticconditionsanditsunderlyingmechanisms[J]．ArchPharmRes，2012，35(2)：223—34．【79】DinhT'VevesA．Microcirculationofthediabeticfoot[J]．CurtPharmDes，2005，11(18)：2301-9．[80】GreenmanRL，PanasyukS，WangX，eta1．Earlychangesintheskinmicrocirculationandmusclemetabolismofthediabeticfoot[J]．Lancet，2005，366(9498)：1711-7．[81】BlakytnyR，JudeE．Themolecularbiologyofchronicwoundsanddelayedhealingindiabetes[J]．DiabetMed，2006，23(6)：594—608．[82】SteinhoffM，StanderS，SeeligerS，eta1．Modemaspectsofcutaneousneurogenicinflammation[J]．ArchDermatol，2003，139(11)：1479—88．[83】EkstrandAJ，CaoRBjomdahlM，eta1．DeletionofneuropeptideY(NPY)2receptorin．86．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究miceresultsinblockageofNPY-inducedangiogenesisanddelayedwoundhealing[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2003，100(10)：6033-8．【84】TodaM，SuzukiT，HosonoK，eta1．Rolesofealcitoningene-relatedpeptideinfacilitationofwoundhealingandangiogenesis[J]．BiomedPharmacother,2008，62(6)：352—9．[85】TecilazichF'DinhTL，VevesA．Emergingdrugsforthetreatmentofdiabeticulcers[J]．ExpertOpinEmergDrugs，2013，18(2)：207-17．【86]LebrunE，Tomic-CanicM，KirsnerRS．TheroleofSUrgicaldebridementinhealingofdiabeticfootulcers【J】．WoundRepairRegen，2010，18(5)：433—8．【87】LipskyBA，PetersEJ，BerendtAReta1．Specificguidelinesforthetreatmentofdiabeticfootinfections201l【J】．DiabetesMetabResRev,2012，28Suppll：234-5．【88】MarstonWA．Dermagrafl，abioengineeredhumandermalequivalentforthetreatmentofchronicnonhealingdiabeticfootulcer[J1．ExpertRevMedDevices，2004，l(1)：21—31．【89】DinhTL，VevesA．TheefficacyofApligrafinthetreatmentofdiabeticfootulcers[J]．PlastReconstrSurg，2006，117(7Suppl)：152S一157S；discussion158S一159S．【90】NiezgodaJA，VanGilsCC，FrykbergRQeta1．RandomizedclinicaltrialcomparingOASISWoundMatrixtoRegranexGelfordiabeticulcers[J]．AdvSkinWoundCare，2005，18(5Pt1)：258-66．【91】SmiellJM，WiemanTJ，SteedDL，eta1．Efficacyandsafelyofbecaplermin(recombinanthumanplatelet-dedvedgrowthfactor-BB)inpatientswithnonhealing，lowerextremitydiabeticulcers：acombinedanalysisoffourrandomizedstudies[J]．WoundRepairRegen，1999，7(5)：335-46．[92]ReesRS，RobsonMC，SmiellJM，eta1．Becaplermingelinthetreatmentofpressureulcers：aphaseIIrandomized，double·blind，placebo-controlledstudy[J]．WoundRepairRegen，1999，7(3)：141-7．[93]Senet只VicautE，BenetonN，eta1．Topicaltreatmentofhypertensivelegulcerswithplatelet-derivedgrowthfactor-BB：arandomizedcontrolledtrial[J]．ArchDermatol，2011，147(8)：926．30．[94】HunterS，LangemoDK，AndersonJ，eta1．Hyperbaricoxygentherapyforchronicwounds[J]．AdvSkinWoundCare，2010，23(3)：116-9．[95】ArgentaLC，MorykwasMJ．Vacuum·assistedclosure：anewmethodforwoundcontrolandtreatment：clinicalexperience[J]．AnnPlastSurg，1997，38(6)：563—76；discussion577．[96】PlikaitisCM，MolnarJA．Subatmosphericpressurewoundtherapyandthevacuum—assistedclosuredevice：basicscienceandcurrentclinicalsuccesses[J]．ExpertRevMedDevices，2006，3(2)：175-84．．87．万方数据 g：-军医大学博士学位论文【97]LiuR，LiL，YangM，eta1．Systematicreviewoftheeffectivenessofhyperbaricoxygenationtherapyinthemanagementofchronicdiabeticfootulcers[J]．MayoClinProc，2013，88(2)：166．75．【98]O’reillyD，PasrichaA，CampbellK，eta1．Hyperbaricoxygentherapyfordiabeticulcers：systematicreviewandmeta-analysis[J]．IntJTechnolAssessHealthCare，2013，29(3)：269-81．[99]MargolisDJ，GuptaJ，HoffstadO，eta1．Lackofeffectivenessofhyperbaricoxygentherapyforthetreatmentofdiabeticfootulcerandthepreventionofamputation：acohortstudy[J]．DiabetesCare,2013，36(7)：1961-6．[100]VigSDC，BergL，CaravaggiC，RomeP，Birke-SorensenH，Bruhina，CharikerM，DepoorterM，Dunn凡DuteilleF，FerreiraF，MartinezJm，GmdzienGHudsonD，IchiokaS，IngemanssonR，JefferyS，KrugE，LeeC，MalmsjoM，RunkelN；IntemationalExpertPanelonNegativePressureWoundTherapy[Newt-Ep]，MartinR，SmithJ．Evidence．basedrecommendationsfortheuseofnegativepressurewoundtherapyinchronicwounds：stepstowardsallinternationalconsensus[J]．JTissueViability．，2011，20Suppl1：S1—18．【101】ChoiJS，KimJD，YoonHS，eta1．Full—thicknessskinwoundhealingusinghumanplacenta-derivedextracellularmatrixcontainingbioactivemolecules[J]．TissueEngPartA，2013，19(3-41：329·39．f102】EspanaEM，HeH，KawakitaT，eta1．Humankeratocytesculturedonamnioticmembranestromapreservemorphologyandexpresskeratocan[J]．InvestOphthalmolVisSci，2003，44(12)：5136．41．【103】Mahrnoudi-RadM，AbolhasaniE，MoravvejH，eta1．Acellularamnioticmembrane：anappropriatescaffoldforfibroblastproliferation[J]．ClinExpDermatol，2013，38(6)：646-51．【104]YangL，ShirakataYTokumaruS，eta1．Livingskinequivalentsconstructedusinghumanamnionsasamatrix[J]．JDermatolSci，2009，56(3)：188-95．【105]WuY，ChenL，ScottPG'eta1．Mesenchymalstemcellsenhancewoundhealingthroughdifferentiationandangiogenesis[J]．StemCells，2007，25(10)：2648—59．【106】BlumbergSN，BergerA，HwangL，eta1．Theroleofstemcellsinthetreatmentofdiabeticfootulcers[J]．DiabetesResClinPracL2012，96(1)：1-9．【107】JavazonEH，KeswaniSGBadilloAT’eta1．Enhancedepithelialgapclosureandincreasedangiogenesisinwoundsofdiabeticmicetreatedwithadultmurinebonemarrowstromalprogenitorcells[J]．WoundRepairRegen，2007，15(3)：350—9．【108】ShinL，PetersonDA．Humanmesenchymalstemcellgraftsenhancenormalandimpairedwoundhealingbyrecruitingexistingendogenoustissuestem／progenitorcells[J]．StemCellsTranslMed，2013，2(1)：33．42．．88．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究【109】ChenLTE，WuPy．Paracrinefactorsofmesenchy7malstemcellsrecruitmacrophagesandendotheliallineagecellsandenhancewoundhealing[J]．PLoSOne．，2008，3(4)．【110]CasteillaL，Planat-Benardv，LaharragueP，eta1．Adipose—derivedstromalcells：Theiridentityandusesinclinicaltrials，anupdate[J]．WorldJStemCells，2011，3(4)：25-33．【1l1】NieC，YangD，XuJ，eta1．Locallyadministeredadipose—derivedstemcellsacceleratewoundhealingthroughdifferentiationandvasculogenesis[J]．CellTransplant,2011，20(2)：205-16．【112】ZhouA，ZhengX，YuL，etal，MechanismsofhumanamnioticepithelialcelltransplantationintreatingstageIIIpressureulcerinaratmodel[J]．ExpTherMed，2015，10(6)：2161-2168．[113】O’loughlinAKM，CreaneM．TopicalAdministrationofAllogeneicMesenchymalStromalCellsSeededinaCollagenScaffoldAugmentsWoundHealingandIncreasesAngiogenesisintheDiabeticRabbitUlcer[J]．Diabetes，2013，62(7)．【l14】SchmittA，RodelP'AnamurC，eta1．CalciumalginategelsaSstemcellmatrix—makingparacrinestemcellactivityavailableforenhancedhealingaftersurgery[J]．PLoSOne，2015，1O(3)：e0118937．[115】MamedeAC，CarvalhoMJ，AbrantesAM，eta1．Amnioticmembrane：fromstructureandfunctionstoclinicalapplications[J]．CellTissueRes，2012，349(2)：447-58．【116】PratamaGVaghjianiVTeeJYeta1．Changesincultureexpandedhumanamnioticepithelialcells：implicationsforpotentialtherapeuticapplications[J]．PLoSOne，201l，6(11)：e26136．【117]DoviJVSzpaderskaAM，DipietroLA．Neutrophilfunctioninthehealingwound：addinginsulttoinjury?[J]．ThrombHaemost，2004，92(2)：275-80．【118]WicksK，TorbicaT，MaceKA．Myeloidcelldysfunctionandthepathogenesisofthediabeticchronicwound[J]．SeminImmunol，2014，26(4)：341—53．【119】WoodS，JayaramanVHuelsmannEJ，eta1．Pro·inflammatorychemokineCCL2(MCP—1)promoteshealingindiabeticwoundsbyrestoringthemacrophageresponse阴．PLoSOne，2014，9(3)：e91574．【120】LealEC，CarvalhoE，TellecheaA，eta1．SubstancePpromoteswoundhealingindiabetesbymodulatinginflammationandmacrophagephenotype[J]．AmJPathol，2015，185(6)：1638—48．[121】ManuelpillaiU，LourenszD，VaghjianiVeta1．Humanamnioticepithelialcelltransplantationinducesmarkersofalternativemacrophageactivationandreducesestablishedhepaticfibrosis[J]．PLoSOne，2012，7(6)：e38631．[122]RohDH，SeoMS，ChoiHS，eta1．Transplantationofhumanumbilicalcordbloodoramnioticepithelialstemcellsalleviatesmechanicalallodyniaafterspinalcordinjuryinrats[J]．Cell．89．万方数据 g：-军医大学博士学位论文Transplant，2013，22(9)：1577—90．[123]XueH，ZhangXYLiuJM，eta1．Developmentofachemicallyextractedacellularmusclescaffoldseededwithamnioticepithelialcellstopromotespinalcordrepair[J]．JBiomedMaterResA，2013，101(1)：145-56．【124】YawnoT，SchuilwerveJ，MossTJ，eta1．Humanamnionepithelialcellsreducefetalbraininjuryinresponsetointrauterineinflammation[J]．DevNeurosci，2013，35(2．3)：272．82．【125】UbertiMGLutkinAE，PierpontYN，eta1．Amnion-derivedcellularcytokinesolutionpromotesmacrophageactivity[J]．AnnPlastSurg，2011，66(5)：575—80．【126】BlessNM，Huber-LangM，GuoRF，eta1．RoleofCCchemokines(macrophageinflammatoryprotein一1beta,monocytechemoattraetantprotein-1，RANTES)inacutelunginjuryinrats[J]．JImmunol，2000，164(5)：2650—9．【127】DeFilippoK，DudeckA，HasenbergM，eta1．MastcellandmacrophagechemokinesCXCLl／CXCL2controltheearlystageofneutrophilrecruitmentduringtissueinflammation[J]．Blood，2013，121(24)：4930—7．[128】GordonS．Alternativeactivationofmacrophages[J]．NatRevImmunol，2003，3(1)：23．35．[129】JainS，TranTH，AmijiM．MacrophagerepolarizationwithtargetedalginatenanoparticlescontainingIL·10plasmidDNAforthetreatmentofexperimentalarthritis[J]．Biomaterials，2015，61：162．77．[130】TecilazichF，DinhT，Pradhan-NabzdykL，eta1．Roleofendothelialprogenitorcellsandinflammatorycytokinesinhealingofdiabeticfootulcers[J]．PLoSOne，2013，8(12)：e83314．[131】MarroReEJ，ChertDD，HakimJS，eta1．ManganesesuperoxidedismutaseexpressioninendothelialprogenitorcellsaccelerateswoundheMingindiabeticmice[J]．JClinInvest,2010，120(12)：4207-19．[132】LiuF'ChenDD，SunX，eta1．Hydrogensulfideimproveswoundhealingviarestorationofendothelialprogenitorcellfunctionsandactivationofangiopoietin-1intype2diabetes[J]．Diabetes，2014，63(5)：1763-78．[133]UmJ，JungN，ChinS，eta1．SubstancePenhancesEPCmobilizationforacceleratedwoundhealing[J]．WoundRepakRegen，2016．[134]HaoYMaDH，HwangDGeta1．Identificationofantiangiogenicandantiinflammatoryproteinsinhumanamnioticmembrane[J]．Cornea,2000，19(3)：348—52．【135]MalhotraC，JainAK．Humanamnioticmembranetransplantation：Differentmodalitiesofitsuseinophthalmology[J]．WorldJTransplant，2014，4(2)：111-21．【136】WolbankS，HildnerF，RedlH，eta1．Impactofhumanamnioticmembranepreparationon．90．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿痈创面愈合的作用及机制研究releaseofangiogenicfactors[J]。JTissueEngRegenMed,2009，3(8)：651-4．[137】ZhuD，MuljadiR，ChanST’eta1．EvaluatingtheImpactofHumanAmnionEpithelialCellsonAngiogenesis[J]．StemCellsInt，2016，2016：4565612．[138】Rosu-MylesM，StewartE，TrowbridgeJ，eta1-Auniquepopulaionofbonemarrowcellsmigratestoskeletalmuscleviahepatocytegrowthfactor／c-metaxis[J]．jCellSci，2005，ns(Pt19)：4343—52．【139】BussolinoF’DiRenzoMF’ZicheM，eta1．HepatocytegrowthfactorisapotentangiogenicfactorwhichstimulatesendothelialcellmotilityandgrowthIJ]．JCellBiol，1992，ll9(3)：629—41．【140】BauerleKT，SchweppeRE，Lundqeta1．NuclearfactorkappaB·dependentregulationofangiogenesis．andmetastasisinallinvivomodelofthyroidcancerisassociatedwi吐1secretedinterleukin-8[J]．JClinEndocrinolMetab，2014，99(8)：E1436-44．【141]StanleyAC，ParkHYPhillipsTJ，eta1．ReducedgrowthofdermalfibroblastsfromchronicvenousulcersCanbestimulatedwithgrowthfactors[J]．JVascSurg，1997，26(6)：994-9；discussion999．1001．[142]MendezMVStanleyA，ParkHYeta1．Fibroblastsculturedfromvenousulcersdisplaycellularcharacteristicsofsenescence[J]，JVascSurg，1998，28(5)：876-83．【143]KimBC，KimHT'ParkSH，eta1．FibroblastsfromchronicwoundsshowalteredTGF—beta-signalinganddecreasedTGF-betaTypeIIreceptorexpression[J]．JCellPhysiol，2003，195(3)：331-6．【144】SpravchikovN，SizyakovGGartsbeinM，eta1．Glucoseeffectsonskinkeratinocytes：implicationsfordiabetesskincomplications【J】．Diabetes，2001，50(7)：1627—35．[145】ZhaoB，LiuJQ，ZhengZ，eta1．HumanamnioticepithelialstemcellspromotewoundhealingbyfacilitatingmigrationandproliferationofkeratinocytesviaERK,JNKandAKTsignalingpathways[J]．CellTissueRes，2016．[146】SchultzGS，DavidsonJM，KirsnerRS，eta1．Dynamicreciprocityinthewoundmicroenvironment[J]．WoundRepairRegen，201l，19(2)：134-48．[147】GuoS，DipietroLA．Factorsaffectingwoundhealing[J]．JDentRes，2010，89(3)：219—29．【148】BoumeGL．Themicroscopicanatomyofthehumanamnionandchorion[J]．AmJObstetGynecol，1960，79：1070-3．【149】VanHerendaelBJ，ObertiC，BrosensI．Microanatomyofthehumanamnioticmembranes．Alightmicroscopic，transmission,andscanningelectronmicroscopicstudy[J]．AmJObstetGynecol，1978，131(8)：872-80．．91—万方数据 第二军医大学博士学位论文[150】MalakTM，OcklefordCD，BellSC，eta1．ConfocalimmunofluorescencelocalizationofcollagentypesI，III，IV,VandVIandtheirultrastructuralorganizationintermhumanfetalmembranes[J]．Placenta,1993，14(4)：385-406．[151]FukudaK，ChikamaT，NakamuraM，eta1．DifferentialdistributionofsubchainsofthebasementmembranecomponentstypeIVcollagenandlamininamongtheamnioticmembrane，cornea,andconjunctiva[J]．Cornea,1999，18(1)：73-9．[152】Dietrich-NtoukasT，Hofmann·RummeltC，KruseFE，eta1．Comparativeanalysisofthebasementmembranecompositionofthehumanlimbusepitheliumandamnioticmembraneepithelium[J]．Cornea,2012，31(5)：564—9．[153】ShahAP．Usingamnioticmembraneallograftsinthetreatmentofneuropathicfootulcers[J]．JAmPodiatrMedAssoc，2014，104(2)：198-202．[154】SheikhES，SheikhES，FetterolfDE．Useofdehydratedhumanamnioticmembraneallograftstopromotehealinginpatientswithrefractorynonhealingwounds[J]．IntWoundJ，2014，11(6)：711-7．[155】ZelenCM，SerenaTE，DenoziereGeta1．Aprospectiverandomisedcomparativeparallelstudyofamnioticmembranewoundgraftinthemanagementofdiabeticfootulcers[J]．IntWoundJ．2013，10(5)：502-7．[156】ZelenCM．AnevaluationofdehydratedhumanamnioticmembraneallograftsinpatientswithDFUs[J]．JWoundCare，2013，22(7)：347-8，350-1．[157】SerenaTE，CarterMJ，LeLT，eta1．Amulticenter,randomized，controlledclinicaltrialevaluatingtheuseofdehydratedhumanamnion／chorionmembraneallograftsandmultilayercompressiontherapyVS．multilayercompressiontherapyaloneinthetreatmentofvenouslegulcers[J]．WoundRepairRegen，2014，22(6)：688-93．【158]ZelenCM，SerenaTE，GouldL，eta1．Treatmentofchronicdiabeticlowerextremityulcerswithadvancedtherapies：aprospective，randomised，controlled，multi-centrecomparativestudyexaminingclinicalefficacyandcost[J]．IntWoundJ，2015．【159]KirsnerRS，SabolinskiML，ParsonsNB，eta1．ComparativeeffectivenessofabioengineeredlivingcellularconstructVS．adehydratedhumanamnioticmembraneallograflforthetreatmentofdiabeticfootulcersinarealworldsetting[J]．WoundRepairRegen，2015，23(5)：737—44．【160]KoobTJ，LimJJ，MasseeM，eta1．Propertiesofdehydratedhumanamnion／chorioncompositegrafts：Implicationsforwoundrepairandsofttissueregeneration[J]．JBiomedMaterResBApplBiomater,2014，102(6)：1353—62．【161】MasseeM，ChinnK，LeiJ，eta1．Deh)rdratedhumanamnion／chorionmembraneregulates．92．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究stemcellactivityinvitro[J]．JBiomedMaterResBApplBiomater,2015．[162】KoobTJ，LimJJ，ZabekN，eta1．Cytokinesinsinglelayeramnionallograftscomparedtomultilayeramnion／chorionallograftsforwoundhealing[J]．JBiomedMaterResBApplBiomater，2015，103(5)：1133-40．一93．万方数据 第二军医大学博士学位论文在读期间发表论文和参加科研工作情况发表论文：1．YongjunZheng，ShizhaoJi，HaibinWu，eta1．Accelerationofdiabeticwoundhealingbyacryopreservedlivingdermalsubstitutecreatedbymicronizedamnionseededwithfibroblasts．AmJTranslRes．2015Dec15；7(12)：2683．93(SCI：3．4分，第—作者)2．YongjunZheng，XingtongWang，ShizhaoJi，eta1．Mepenzolatebromidepromotesdiabeticwoundhealingbymodulatinginflammationandoxidativestress．AmJTranslRes．(SCI：3．4分，第一作者，己接收)3．郑勇军，夏照帆．皮肤抗菌肽的研究进展．国际免疫学杂志2013；36(3)：204．207(第一作者)4．YongjunZheng，ShizhaoJi，HalbinWu，eta1．Topicaladministrationofcryopreservedlivingmicronizedamnionacceleratesdiabeticwoundhealing．Diabetes．(SCI：8．47分，第—作者，underreview)5．JiShizhao，ZhengYbngjUn，ZhangLisen，eta1．Short—andlong-termoutcomesofsmallauto-andcryopeservedallo—skinmixedgraftingformorethan60％TBSAdeepbumwoundsrepair：12··yearexperienceinChinaBums．(SCI：1．96分，共同第—作者，underreview)6．ZhangYQ，JiSZ，FangH，ZhengYJ，LuoPF，WuHB，WuMJ，WangZH，XiaoSC，XiaZF．UseofamnioticmicroparticlescoatedwithfibroblastsoverexpressingSDF-latocreateanenvironmentconducivetoneovascularizationforrepairoffull-thicknessskindefects．CellTransplant．2016；25(2)：365．76．(SCI：3．1分，第4作者，已见刊)7．WuM，JiS，XiaoS，KongZ，FangH，ZhangY，JiK，ZhengY，LiuH，XiaZ．JAM·Apromoteswoundhealingbyenhancingbothhomingandsecretoryactivitiesofmesenchymalstemcells．ClinSci(Lond)．2015Oct；129(7)：575—88．(SCI：5．6分，己见刊)8．常菲，房贺，贲道锋，罗鹏飞，郑勇军，张梅，夏照帆，路卫．无菌生物膜在小儿浅II度烧伤创面中的临床应用．中华损伤与修复杂志·电子版．2013；8(4)：30．33(已见刊)9．AnaTellechea,ErmelindoC．Leal，AntoniosKafanas，MichaelE．Auster,SaradaKuchibhotla,YanaOstrovsky,FrancescoTecilazich，DimitriosBaltzis，YongjunZheng，EugtniaCarvalho，JaniceM．Zabolotny,ZuyiWeng,AnastasiaPetra,ArfiPatel，SmaroPanagiotidou，LeenaPradhan-Nabzdyk，TheoharisC．Theoharides．AristidisVeves．MastCellsRegulateWoundHealinginDiabetes．Diabetes(SCI：8．4分，已接收)．．94．．万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究参与基金：1．活性羊膜微粒治疗慢性创面机制及临床研究，第二军医大学博士创新基金，排名第12．活性羊膜微粒治疗慢性创面实验研究，第二军医大学优秀硕士苗子基金，排名第13．JAMl基因修饰间充质干细胞促毛发再生的机制研究，国家自然科学基金委81301649，排名第54．模拟创面生态微环境构建富含活性因子天然微型真皮支架的实验研究，国家自然科学基金委，2015H1505，捧名第5专利：1．纪世召郑勇军肖仕初夏照帆李廷王光毅孙颖．负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用．申请号：201510435208．0(国家发明专利)2．肖仕初田松夏照帆吴海斌郑勇军王志红纪世召．一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置及方法．申请号：201410475101．4(国家发l秀等利)3．仵敏娟夏照帆刘厚奇纪世召郑勇军肖仕初房贺．链接粘附分子JAM．A促进皮肤创面修复的方法及其应用．申请号：201510367008．6(国家发明专利)学术任职：SCI杂志Wounds：ACompendiumofClinicalResearchandPractice编蚕参编著作：1．《创伤烧伤与再生医学》2014．4ISBN：9787117186506付小兵主编2．《TheDiabeticFoot．MedicalandSurgicalManagement．4thedition)AristidisVeves主编．95．万方数据 第二军医大学博士学位论文致谢时光冉冉，五年研究生生涯弹指一瞬，五年前刚走进第二军医大学校门的情景仍清晰可见。在论文结束处，感谢每一个走进我生命的人，是你们的关心支持与鼓励帮助我一步步走向成熟，见证我这五年的点点滴滴。首先特别感谢我的导师夏照帆教授。感谢五年前从武汉保研来上海面试时您选中了稚嫩的我。现在仍清晰记得五年前保研面试那天早上由于吃坏肚子而上吐下泻，您作为面试专家组组长关怀各至，让刚来上海一切都非常陌生的我倍感温暖。这五年研究生生涯中，是您的严格要求与悉心指导，从实验选题、实验设计到结果分析与论文撰写各个环节的严格把关，才让我课题逐步顺利完成；是您在生活像母亲一样无微不至的关怀，才让我在上海有家的感觉；是您拼搏不息与执着追求的精神，让我遇到困难时选择了咬咬牙挺过去；是您严谨治学的态度与对科学的热爱，让我一直以您为榜样，静心专研学术不断进取：是您不断的鼓励与支持，让我从一次次挑战中体会到成功的喜悦。您是严师，在我犯错时严厉批评，教导我第一是做人，然后才是做事与做学问；您更是慈母，关心帮助我生活的点点滴滴。在即将毕业之际，向您表示最诚挚的感谢和崇高的敬意!感谢葛绳德教授不顾高龄及严寒酷暑坚持给我们上英语课。感谢导师组成员肖仕初教授、朱世辉教授、唐洪泰教授、路卫教授、贲道锋教授、王光毅副教授、王广庆副教授、程大胜副教授、马兵副教授、吕开阳副教授、孙瑜副教授、朱峰副教授在临床科研及论文撰写等方面的细心指导和无私帮助。尤其感谢肖仕初教授，感谢您在科研选题、实验设计及论文撰写各个方面给的细微之至的关心与帮助，感谢您无数个夜晚在值班之余还要操心我的课题，您总是能直中要害找出我科研中的不足，每次您的指导总让我有醍醐灌顶豁然开朗的感觉，是您的悉心指导让我能顺利发表多篇论文。感谢烧伤科曹青老师、高美芝老师、姜玉老师、胡晓燕老师、郑兴锋师兄、陈郑礼师兄、常菲医师、刘嘉楠医师、刘晓斌医师、周万芳护士长、冯苹护士长以及全体医护人员给我提供的无私帮助和指导。感谢实验室罗鹏飞师兄、郦佳慧老师、王俊杰老师、韩姝老师、杨晓妍老师、刘莹莹老师、王志红老师、王丽老师在课题选题、实验设计及实施过程中的帮助与支持，尤其是王丽老师对我实验的帮助，厚厚的几十盒切片倾注了你很多的心血，没有您的帮助就没有我博士课题的顺利完成。感谢组胚教研室仵敏娟老师对我实验设计及实验实施过程中的指导和帮助，感谢施老师教我石蜡包埋及病理切片，感谢许正雨师兄、蒋俊锋师兄、徐辰博士、胡玲丽师妹对我实验的无私帮助。．96—万方数据 冻存活性微粒羊膜促糖尿病创面愈合的作用及机制研究感谢实验室一起奋斗过的师兄师姐们：纪世召博士、黄国锋博士、孔征东博士、罗鹏飞博士、房贺博士、汤焘博士、张放博士、邱啸臣硕士、张云卿硕士、张梅硕士，感谢你们在这五年研究生生涯中对我生活的关心与实验的指导。尤其感谢师兄纪世召博士和师姐张云卿硕士，是你们将我引入了科学的大门并手把手教我实验技术。感谢师兄纪世召博士，这五年来您一直是我学习的榜样。作为创面修复组的精神领袖，您对科学的热爱与孜孜不倦的拼搏精神带领团队不断突破困难取得成功。是您在第一天进入实验室时就告诫我五年研究生生涯弹指一挥间，一定要抓紧时间不给自己留下遗憾，让我这五年一直不敢松懈。感谢王钟山博士、沈拓硕士及师弟吴海斌博士、王星童博士、伍国胜博士、王亮博士、范晓明博士、田松硕士、李磊硕士、刘功成硕士、弓辰硕士、李廷硕士、姜浩硕士、张立森硕士、郑晓鹏硕士、何放硕士、陈甜胜硕士、洪旭东硕士、王晨硕士、肖咏镪硕士、郑仕清硕士、李海航硕士、盛嘉隽硕士、鲁晋硕士、方潇硕士、金剑硕士对我五年来的帮助和支持，是你们让我研究生生活多姿多彩。感谢邓师傅几年如一日为我们的小老鼠提供了安静而舒适的环境才保证我们课题的顺利完成。感谢我的第二位导师美国哈佛医学院AristidisVeves教授在波士顿学习期间对我实验的指导，您严谨的治学态度与对科研的热爱让我见识了世界一流科学家所具有的品质。感谢您带我参加了那么多国际会议，极大的开阔了我的视野；感谢您在每月举行的多学科交叉的组会上鼓励我多发言多思考，让我从哈佛材料、干细胞与药学研究的各位老师那儿学到了很多；感谢您推荐我任专业学术杂志编委并参编美国糖尿病足教科书。感谢美国实验室一起工作学习的兄弟姐妹们：助理研究员美国小美女DanielleEschuk，好兄弟希腊大帅哥DimitriosBaltzis，印度禅师SeemaDangwal，年轻有为的法国副教授MatthieuRoustit,肌肉男JordanLoader，精通4门以上语言的荷兰AriaLuisa．AlvesTellechea及美国LiciaAdouane，可爱单纯的实习小姑凉CarlyDeusenbery，亦师亦友的中山大学一附院副教授BinShu，西京医院副教授JianfangFu，北大中日友好医院美女学霸WanniZhao。在这样一个来自世界各地的大团队里，每一天都很新鲜并充满各种乐趣，是你们让我体验了不一样的生活并发现一个崭新的世界。感谢哈佛医学院JohnM．Giurini教授和ThanhDinh副教授对我临床的指导，在出门诊时不厌其烦的给我讲解各个病例，您们对临床的热爱、对技术的精益求精与完美的医患沟通将成为我日后行医的榜样。感谢长木转化医学中国计划的哈佛刘小乐教授、王济平教授、党平老师、姚东东医生、PeterHou医生、马浩波医生等，让我每周听课中尽快了解美国医疗环境及最新科研动态，并认识了很多国内访学的朋友。感谢波士顿学习期间二军大校友王英老师、张煜辉教授、陈韬医生、张晶医生、周海洋医生、莫烽锋老师、金海博士、陈颖博士、蔡亚梅博士、．．97．．万方数据 g_-军医大学博士学位论文李晓童博士对我学习生活的照顾。特别感谢好基友白自胖胖的神外金小海博士和药学院青春无敌美少女陈小颖博士，怀念波士顿一起美食一起出游一起压马路一起打升级一起分享吐槽一起微信群里各种污的生活，是你们让我的留学生活充满各种乐趣。感谢室友詹以萱、JoyceLiu、卓恺明医生对我生活的照顾。感谢杨阮博士、王岩博士、夏庆锋博士、王飞宇博士、王付博师兄，怀念一起游历美国的日子。感谢王爱萍主任、胡月硕士、阎格博士、李志寰博士、雷鹏飞博士等好友，认识你们是我此生的荣幸。特别感谢美国肿瘤医生范阿姨，从哈佛的偶然认识到经常的长谈，感谢您让我对美国的临床与科研有了新的认识。感谢您对我的信任与鼓励让我发现自己的另一面，感谢您带我去参加聚会认识了很多以前只能仰望的牛人。亦师亦友，能在大洋彼岸认识您并成为忘年交，是我在美国最大的收获。感谢硕士室友韦腾飞硕士、史征硕士、单兴华硕士、韦荣超硕士对自己学习和生活的帮助，感谢博士303寝室江远亮博士、方梓宇博士、章云童博士、陈勇军博士给我博士生活带来的各种欢乐，特别是江远亮博士和方梓宇博士，从当初保研时一起去世博会到最后成为室友朝夕相处，也许以后很多年我仍会怀念一起扯淡夜聊一起健身的日子，作为一辈子的好兄弟，感谢你们陪我一起成长。感谢好友王飞宇博士、刘牧云博士、方硕博士、朱莹博士、文良志博士等对我这五年的关心与帮助。感谢跆拳道朱冲霄教练、姜再华教练、动感单车sasa教练带我锻炼出强健的体魄。最后感谢我的父母和妹妹。虽然爸妈你们只有小学文化，但在学习上全力支持我和妹妹，最后你们培养了一个博士和一个大学生。是你们教我做事要脚踏实地，做人要守本分，对朋友要一诺千金。已经记不清多少年每年只能回家呆几天了，每次离家也是草草告别，直到出国后刚到美国由于没找到网络和电话晚了十几个小时报平安时一向坚强的母亲在电话那头低声哭涕，我才知道无论多大，我都是你们一辈子的牵挂。感谢这么多年来父母对我一直的鼓励与支持，感谢你们对我和妹妹的付出。感谢妹妹在我博士期间对父母的照顾，让我能安心自己的学业。长兄为父，但我一直很愧疚在外求学这么多年我们聚少离多，我错过了你的恋爱，在国外求学时错过了你的婚礼，也错过了小外甥的降生。感谢你们的理解和支持，希望我能成为你们的骄傲!我性格慢热、情感内敛，再次感谢我所有的亲人朋友们这么多年对我的理解和包容，祝你们永远快乐幸福!郑勇军2016年3月上海．98一万方数据