大黄素促糖尿病溃疡愈合的作用及机制探讨

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________大黄素促糖尿病溃疡愈合的作用及机制探讨姓名：韩延忠学号：2111548097院系：中药学院学位类型：专业学位专业：中药学研究方向：中药药效评价与临床应用研究导师：朱家勇教授论文提交日期：2018年3月20日论文答辩日期：2018年5月23日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文EffectandmechanismofemodinonskinwoundhealingindiabeticmiceCandidate：YanzhongHanSt

2、udentID：2111548097Affiliation：SchoolofTraditionalChineseMedicineAcademicDegreeApliedfor：ProfessionaldegreeofChineseMateriaMedicaSpeciality：StudyontheefficacyevaluationandclinicalapplicationofTraditionalChineseMedicineSupervisor：Prof.JiayongZhuAssistantSupervisor：SNENGR.ZhongZhengDayofDefence：M

3、ay2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversity052018广东药科大学硕士研究生学位论文大黄素促进糖尿病溃疡愈合的作用及机制探讨摘要研究背景和目的:糖尿病溃疡是糖尿病并发症之一，也是临床上治疗的难题，其特点是高度难愈合、高致残率和高医疗费用，严重影响人民身体健康，给社会带来沉重的经济负担。目前的治疗方法与药物主要有清创引流、敷料、富血小板血浆、抗生素等。尽管有所进展，但药物疗效并不理想，仍急需开发天然安全治疗糖尿病溃疡的有效药物。大黄具有凉血、解毒、通经、逐瘀等功效。大黄素是中药大黄的重要单

4、体成分，具有抑菌、免疫调节、改善微循环等药理学活性，现已研究显示大黄素局部给药能加速急性创面的愈合，表明大黄素在创面修复中存在巨大潜能。但是对于糖尿病溃疡愈合是否有效果尚无相关报道。因此，本课题拟采用糖尿病db/db小鼠（C57BL/6J-db/db）建立稳定的溃疡动物模型，研究大黄素促糖尿病溃疡愈合的药理作用，采用转录组学的方法研究大黄素促溃疡愈合的相关作用机制，并根据其结果从炎症免疫调节、细胞外基质沉积等方面阐明其具体作用机制。研究方法:1.两种糖尿病小鼠溃疡创面愈合的比较:统计C57BL/6J-db/db和STZ诱导的C57BL/6J两种糖尿病溃疡小鼠的创面愈合时间、愈合速率

5、；HE染色观察病理组织变化；免疫组化检测血管新生；RT-PCR检测创面修复相关基因表达水平。2.大黄素促糖尿病小鼠溃疡创面愈合的作用评价:全皮层切除构建C57BL/6J-db/db小鼠溃疡创面模型，大黄素局部给药；统计创面愈合率、愈合时间；免疫组化检测血管新生；免疫荧光检测抗炎性M2巨噬细胞比例；ELISA检测TNF-α、IL-6水平；基于转录组对溃疡创面组织的测序分析。I广东药科大学硕士研究生学位论文3.大黄素对体外巨噬细胞的影响:体外培养C57BL/6J小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞并鉴定其纯度；流式检测大黄素极化巨噬细胞后M2型巨噬细胞比例；脂多糖诱导的巨噬细胞炎症模型，大黄素处

6、理后，ELISA试剂盒检测细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6的表达情况，蛋白质免疫印迹检测NF-κB通路中phospho-P65、phospho-IκB-α蛋白的表达情况。4.大黄素对体外成纤维细胞的影响:通过MTT实验、划痕实验、Transwell实验检测大黄素促成纤维细胞增殖的最佳浓度及促迁移趋化效果；通过RT-PCR检测与ECM生成相关的Fibronectin、Collagen-Iα、Collagen-IIIα基因的表达变化。5.大黄素对巨噬细胞与成纤维细胞共培养的影响:经大黄素处理共培养的两种细胞后，ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF-α、IL-6；通过MTT、迁移实

7、验、RT-PCR等实验检测成纤维细胞的增殖、迁移、ECM生成相关基因的表达；通过流式、RT-PCR检测M2巨噬细胞比例及表型基因。研究结果:1.两种糖尿病小鼠溃疡创面愈合的比较:C57BL/6J-db/db小鼠（20.2±1.3d）较STZ诱导的小鼠（16.6±0.8d）的愈合时间明显延迟（P<0.001）；7d，C57BL/6J-db/db小鼠溃疡创面中的炎性细胞浸润严重，未出现肉芽组织；7d，其血管新生、细胞增殖、ECM生成相关基因Collagen-IIIα和α-