超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激.doc

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1、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激素类药物张峰1许成保1,2蓝芳3王秀娟1雍炜1锁然2储晓刚1*丁菲1,4吕泉福1,51（中国检验检疫科学研究院，北京100123）2（河北农业大学食品科技学院，保定071000）3（深圳出入境检验检疫局，深圳518033）4（浙江中医药大学药学院，杭州310053）5（西南大学药学院，重庆400715）摘要建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析动物饲料中违禁添加的去氢睾酮(BOL)、表睾酮(epiAn)、氟甲睾

2、酮(FT)、去氢甲睾酮(美雄酮)(MD)、甲睾酮(MT)、丙酸诺龙(NP)、诺龙(N)、丙酸睾酮(TP)和睾酮(T)9种药物的分析方法。样品经乙酸乙酯振荡提取，再用基质固相萃取方法净化处理后，采用UPLC-Q-TOF-MS分析检测。在电喷雾正离子模式和飞行时间模式下，输入各化合物的精确分子离子质量数得到相应的提取离子色谱图，以色谱峰面积进行定量分析。通过碰撞诱导解离模式（CID）得到各化合物碎片离子的精确质荷比，进一步对各化合物进行定性分析。各化合物的质量精确度均小于5ppm，9种化合物在0~100

3、0μg/L范围内均呈良好的线性关系，线性系数均大于0.99。除诺龙和去氢甲睾酮外，本方法对各药物的检出限（LOD）均低于6μg/L；去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮(美雄酮)、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮的定量限（LOQ）分别为16﹑10、20、43、20﹑12﹑15﹑10g和16μg/kg。3个添加水平（LOQ、2LOQ、4LOQ）的回收实验表明，化合物的回收率在70.0%～99.7%范围内，相对标准偏差(RSD)均小于10%。本方法的定性准确度明显高于文献报道的方法，可用于饲料中

4、的禁用雄性激素药物的定性确证和定量测定。关键词液相色谱-四极杆-飞行时间质谱；饲料；雄性激素1引言雄性激素是一类生物体内产生的调节机体代谢或生理功能的物质，在养殖业中用于促进动物生长、提高蛋白转化率，以达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的。研究表明，雄性激素药物可通过饲料进入到动物组织，被人体摄入后，残留的雄性激素会干扰人体内自然激素的平衡，引起妇女出现类似早孕的反应以及乳房肿胀、不规则出血等，影响肝脏功能，导致新生儿畸形，并且使人体患癌症的几率大大提高。因此，欧盟95/22/EC规定禁止在饲料中使

5、用雄性激素药物，我国也颁布了相关的法律，禁止在饲料中使用雄性激素药物，但是违规使用的案例仍时有出现，所以发展一种快速、准确的检测方法显得很有必要。常用的雄性激素的检测方法包括酶联免疫分析法（ELISA）[1]、气相色谱法(GC)[2,3]、气相色谱质谱法（GC-MS）[4~6]、液相色谱法(HPLC)[7]、液相色谱质谱法(LC-MS)[8,9]和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）[10,11]等。ELISA、GC和HPLC的方法灵敏度较低,选择性和特异性较差,已经不适于雄性激素痕量残留分析的要求

6、。GC-MS、LC-MS和LC-MS/MS虽然方法灵敏度和特异性都比较高,但是，由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息，定性准确度方面尚有欠缺，容易产生假阳性的结果。四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)技术可对化合物进行精确分子质量的测定，并依据所测得的化合物的精确分子质量对其进行确证分析，同时在碰撞诱导解离（CID）模式下，得到化合物及其碎片离子的分子式和精确分子质量，可进一步对化合物的结构和裂解规律加以确证，定性准确性很高。目前，尚未有应用Q-TOF分析雄性激素的文献报道。本研究采用超高效液相色谱-

7、四级杆飞行时间质谱联用技术，建立了动物饲料中雄性激素的精确分析方法。优化了前处理方法和色谱质谱条件，建立了动物饲料中去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮(美雄酮)、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮共9种违禁添加的雄性激素定性确证方法和定量测定方法。9种雄性激素的结构式如下：氟甲睾酮（Fluoxymesterone）去氢甲睾酮（Metandienone）诺龙（Nandrolone）去氢睾酮（Boldenone）丙酸诺龙（Nandrolone17-propionate）表睾酮（Epiandros

8、terone）睾酮（Testosterone）甲睾酮（Methyltestosterone）丙酸睾酮（Testosteronepropionate）1实验部分2.1仪器与试剂ACQUITUltraPerformanceLCTM超高效液相色谱仪,SynaptQ/TOF四极杆/飞行时间质谱仪(Waters公司)；均质器；超声器；振荡器；离心机；旋转蒸发仪。甲醇、乙酸乙酯（HPLC级,Fisher科技公司）；甲酸（纯度49%~51%）；N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷