胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性论文

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1、胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性论文【摘要】目的利用人胃癌细胞系（GC9811）在裸小鼠体内反复接种建立一株具有腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(GC9811P)，并对其生物学特性进行观察，为实验研究提供模型。方法采用胃癌细胞系(GC9811)在裸小鼠腹腔内反复接种，行体外培养腹膜转移灶筛选高转移亚系，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜下观察细胞形态，利用流式细胞仪、染色体分析等方法，研究该高转移亚系的细胞周期、增殖、染色体核型等生物学特性。结果母本细胞系GC9811腹膜转移形成率为33.3%(3/10).freell/L的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片并染色，以

2、日立JEM2000型透视电镜及扫描电镜观察细胞超微结构。1.2.3细胞增殖特性的研究用MTT法测定细胞生长曲线。调整GC9811与GC9811P细胞浓度,分别按1×103个细胞/孔接种于96孔板中，每孔加200μl培养液，置37℃、CO2孵箱中培养，每个样品重复3孔，每天用MTT比色法测定3孔中的A职（为490nm），绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定细胞周期及DNA含量：收集对数生长期的GC9811与GC9811P细胞用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液联合消化细胞，制备单细胞悬液，用PBS洗涤两遍，垂悬于5ml、4℃预冷的PBS中，95%的乙醇固定

3、，调整细胞数为1×105/ml，经溴化乙锭染色后，在流式细胞仪上测定细胞周期及DNA含量。1.2.4体外侵袭实验参照Albini等体外侵袭实验方法。Boyden(Biotech公司)小室上下室之间铺有直径为6.5mm的聚碳酸酯微孔滤膜（孔径为8μm），膜上均匀铺人工基底膜胶（matrigel）50μɡ/孔，下室加入NIH3T3细胞无血清条件培养上清200μl作为趋化因子，将小室置于37℃温箱中聚合30min。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，向上室中加入细胞悬液400μl，37℃，5%CO2孵箱中放置12h。弃上室液体，拭尽膜上未侵袭的细胞及人工基

4、底膜胶，甲醇固定30min，常规HE染色。每个细胞同时做3个小室，200倍光镜下将膜以水平线及垂直线分为4个象限，在每个象限及膜中心取1个视野记数，取其均值。1.2.5染色体分析取对数生长期的GC9811P细胞，按文献2所述方法制片，镜检100个分散良好且完整的中期分裂相进行染色体分析。1.2.6双层琼脂试验按常规方法检测克隆形成率。1.2.7支原体检测采用透射电镜、地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体。1.2.8体内成瘤性检测将生长旺盛的GC9811与GC9811P细胞制成0.2ml细胞悬液（含106～107个细胞）接种于12只3～4周龄的裸鼠背侧或

5、腋下皮下，观察致瘤性，瘤结节每五天用卡钳测量肿瘤长径a和短径b并用公式,TsujinakaT,etal.EstablishmentofavisibleperitonealmicrometastaticmodelfromagastricadenocarcinomacelllinebygreenfluorescentproteinJ.IntJOncol,2000,16(5):893898.［3］白飞虎，郭新宁，杨力，等.人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立［J］.第四军医大学学报，2003，24(10):873875.4BaiFH,GuoXN,YangLi，etal.

6、VEGFsignificanceinperitonealrecurrencefromgastriccancerJ.GastricCancer,.freelgastriccancerJ.GastricCancer,2005,8(3):155163.［6］JansenB,VckunFM,JaszczP2、MMP9和TIMP1的表达与胃癌淋巴结转移及时间的关系J.肿瘤防治研究，2005，32（5）：274275.［8］李晓梅，耿敬姝，石清涛,等.同种异体移植瘤在不同组织微环境中生物学行为的差异及机制J.肿瘤防治研究，2005，32（4）：226227.