人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达论文

《人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达论文李燕杰，李吉学，凌焱，汤国营，林艳丽，朱厚础【关键词】人乙酰肝Cloning,expressionandcharacterizationofhumanheparanseCterminalsubunitproteininE.coli【Abstract】AIM:Toconstructtheexpressionvectorforheparanase(HPA)Cterminalsubunitandobtainenoughproteinforfurtherstudy.METHODS:Fullencodinggeneofheparanaseprot

2、einthehumanplatentacDNAlibraryanditsexpressingvectorpGEX2TK50kuHPAinalsubunitgeneintothepGEX2TKvector.Aftertransformedbytheexpressionvector,E.coliBL21(PlyS,DE3)inalsubunitproteinafter1hinductionandkeptproducingituntil3hafterinductionaximum.Nodegradationofproducedproteinostlyininclusivebodies.T载

3、体，测定基因序列.1.2.2构建载体PGEX2TK50kuHPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50ku大亚基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC3′，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，5′CGGAATTCTCAGATGCAAGCAGCAACTTTGG3′,其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点.PCR条件为：95℃5min变性进入循环；94℃30s，60℃30s,72℃30s，30个循环后72℃继续延伸5min.20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物.将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载体

4、连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50kuHPA，转化DH5α.测序鉴定表达载体的序列和阅读框架.1.2.3温度、诱导时间、浓度对表达的影响①温度对表达的影响：将重组表达质粒pGEX2TK50kuHPA转化大肠杆菌BL21（DE3,PLyS），挑取重组子单菌落接种于LB液体培养基（氨苄青霉素100mg/L,氯霉素34mg/L）中，分别于25℃，30℃，37℃进行诱导表达，收集菌液，进行SDSPAGE分析.②诱导时间对表达的影响：加入IPTG后继续培养5h诱导目的蛋白表达,每隔1min取1mL培养物，离心收集菌体分析.③诱导剂浓度对表达的影响：加IPTG至终

5、浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol/L，37℃,200r/min继续培养3h，分别取1mL菌液，离心收集菌体分析.1.2.4表达产物的可溶性分析取2mL细菌培养物，离心收集菌体，用去离子水洗涤1次，重悬于1mL去离子水中，超声波低温破碎菌体，离心，收集上清，另将所得沉淀用去离子水洗1次，重悬于蒸馏水中，分别取上清和沉淀进行SDSPAGE分析.2结果2.1人乙酰肝素酶基因的分离扩增与鉴定PCR扩增产物在8g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带，长度约1600bp(图1).经序列测定和比较，此基因为人乙酰肝素酶全长编码基因.

6、2.2乙酰肝素酶50ku大亚基基因序列的扩增乙酰肝素酶50ku大亚基基因序列的PCR扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带，与预计的1161bp完全吻合（图2）.2.3重组质粒pGEX2TK50ku的构建、转化与克隆菌株的鉴定将重组质粒pGEX2TK50ku转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得大量转化子.从中随机挑选几个重组子单菌落，以PCR方法进行鉴定.琼脂糖凝胶电泳结果（图3）显示，采用以pGEX2TK载体测序引物P1和P2扩增出了大小为1.1kb的特异性片段，表明所检测的克隆中均含有外源目的片段插入.选取一个重组子，提取质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定，出

7、现1.1kb的电泳带（图4），与预期结果相符，表明重组质粒构建完全正确.2.4重组质粒PGEX2TK50ku的序列测定结果将阳性重组子送测序公司测序，阅读框架正确，无移码，序列没有突变，可以进行目的蛋白的诱导表达.2.5表达质粒pGEX2TK50ku在大肠杆菌中的表达含有重组质粒pGEX2TK50ku的大肠杆菌BL21（DE3,PlyS）分别在25℃，30℃和37℃经IPTG诱导后，SDSPAGE电泳显示在分子质量约76ku处均有一蛋白表达带，为乙酰肝素酶