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时间:2018-11-21
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1、新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义论文张定荣张海鸿车芬芳徐书珍【摘要】目的观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化,以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法出生7d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型,并于窒息后1、3、5和7d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκBp65活性表达水平,用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果B组脑组织NFκB的表达较A组显著增强(P0.05),以5d时升高最明显;并
2、伴有神经细胞坏死及凋亡现象。结论NFκB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。【关键词】NFκB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤;脑组织【Abstract】ObjectiveToobservetheactivationofNFκBinhypoxiaischemiareperfusionbraininjuryofneofstudyistoexploretheeffectofNFκBsignalpathentalbaseforfindingclinicaltreatmentofasphyxia,inlydividedint
3、ocontrolgroup(A)andasphyxiagroup(B).Themodelofasphyxiamunohistochemicalmethodatoxylineosinstainingedtoobservethehistologicalevidenceofasphyxiainthebrain.ResultsTheactivityofNFκBP65ayplayanimportantroleinbraininjuryiareperfusion,braintissue脑组织中的NFκB能被许多因素激活,其中包括窒息后脑
4、组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFκB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中,在调节炎症反应的基因中起关键作用,与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关1。本实验建立新生鼠窒息动物模型.freell的缺氧瓶(即磨口瓶,保证密闭性)中,内装0.005kg钠石灰,待动物安静后,塞紧瓶塞,密闭30min后,立即氧罩吸氧2h(氧浓度50%~60%),之后放回笼中,仍由母鼠哺乳喂养。②对照组动物模型:模拟上述过程不塞紧瓶塞,仍由母鼠哺乳喂养。1.3方法1.3.1标本采集:分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊
5、髓,在冰盘上快速取全脑组织,以冰生理盐水清洗至无血迹,切取含有海马组织的脑片,所有标本均经10%的中性福尔马林固定,经58~60℃石蜡包埋后,连续切片2张,厚度为4μm,烤片30min,供免疫组化和病理检查用。1.3.2新生鼠脑组织NFκBp65蛋白活性检测:采用免疫组化法,标本测定一次完成。测定步骤:①组织切片;②3%H2O2去离子水孵育;③蒸馏水冲洗;④80%火力微波修复;⑤PBS洗3次;⑥滴加正常山羊血清封闭液;⑦滴加适当稀释的一抗;⑧PBS振洗3次;⑨滴加生物素化二抗工作液;⑩PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PB
6、S振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水,中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。1.3.3脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变,脑细胞损伤情况,帮助判断坏死和凋亡细胞。1.4统计学处理所得数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理,进行多因素方差分析,两组间比较用t检验,P0.05差异有统计学意义。2结果2.1NFκBp65结果判断阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积,定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化
7、结果进行评估,即在高倍镜下(×200)随机观察10个视野,计数1000个细胞中的阳性细胞数,计算出阳性细胞百分率,免疫组化染色图片见图1、2。2.2脑组织病理学判断参照图谱1,①正常神经细胞结构:锥体细胞呈椭圆型,核染色质疏松,核仁清楚;②神经细胞损伤:胞体缩小,呈三角形或长条形,胞核固缩深染,核仁消失,细胞与周围间隙增宽。2.3神经症状评分从缺氧开始观察24h,观察异常神经症状并进行评分。评分标准4:竖毛震颤,运动减少各计1分;瘫痪、旋转、抽搐各计3分;昏迷计6分。结果见表1。A组无神经系统症状,而B组出现明显神经系统症状(P0
8、.05),B组各亚组与A组相比均有显著性差异(P0.05),以Bb及Bc组最显著,Bd组趋于稳定,随时间延长,在一定时间后神经症状可能逐渐好转,但未作进一步观察。表1各组异常神经症状评分(x±s,.freelin,复氧1、3、5和7d四个时相点,N
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