新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤nfκb的表达及意义

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1、新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义【摘要】目的观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFκB动态变化，以探讨NFκB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法出生7d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型，并于窒息后1、3、5和7d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFκBp65活性表达水平，用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果B组脑组织NFκB的表达较A组显著增强(P<0.05),以5d时升高最明显;并伴有神

2、经细胞坏死及凋亡现象。结论NFκB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。【关键词】NFκB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤;脑组织　　【Abstract】ObjectiveToobservetheactivationofNFκBinhypoxiaischemiareperfusionbraininjuryofneofstudyistoexploretheeffectofNFκBsignalpathentalbaseforfindingclinicaltreatmentofasphyxia,inlydivi

3、dedintocontrolgroup(A)andasphyxiagroup(B).Themodelofasphyxiamunohistochemicalmethodatoxylineosinstainingedtoobservethehistologicalevidenceofasphyxiainthebrain.ResultsTheactivityofNFκBP65ayplayanimportantroleinbraininjuryiareperfusion,braintissue　　脑组织中的NFκB能被

4、许多因素激活，其中包括窒息后脑组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFκB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中，在调节炎症反应的基因中起关键作用，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关[1]。本实验建立新生鼠窒息动物模型，旨在探讨NFκB信号途径在新生鼠窒息中的作用，为进一步治疗新生儿窒息提供新的思路。　　1材料与方法　　1.1实验动物及分组七日龄l的缺氧瓶(即磨口瓶，保证密闭性)中，内装0.005kg钠石灰，待动物安静后，塞紧瓶塞,密闭30min后，立即氧罩吸氧2h(氧浓度50%～60%)，之

5、后放回笼中，仍由母鼠哺乳喂养。②对照组动物模型：模拟上述过程不塞紧瓶塞，仍由母鼠哺乳喂养。　　1.3方法　　1.3.1标本采集：分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊髓，在冰盘上快速取全脑组织，以冰生理盐水清洗至无血迹，切取含有海马组织的脑片，所有标本均经10%的中性福尔马林固定，经58～60℃石蜡包埋后，连续切片2张，厚度为4μm，烤片30min，供免疫组化和病理检查用。　　1.3.2新生鼠脑组织NFκBp65蛋白活性检测：采用免疫组化法，标本测定一次完成。测定步骤：①组织切片;②3%H2O2去离子水孵

6、育;③蒸馏水冲洗;④80%火力微波修复;⑤PBS洗3次;⑥滴加正常山羊血清封闭液;⑦滴加适当稀释的一抗;⑧PBS振洗3次;⑨滴加生物素化二抗工作液;⑩PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PBS振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水，中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。　　1.3.3脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变，脑细胞损伤情况，帮助判断坏死和凋亡细胞。　　1.4统计学处理所得数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.0统计软件进行

7、统计学处理，进行多因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05差异有统计学意义。　　2结果　　2.1NFκBp65结果判断阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积，定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估，即在高倍镜下(×200)随机观察10个视野,计数1000个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞百分率，免疫组化染色图片见图1、2。　　2.2脑组织病理学判断参照图谱[1]，①正常神经细胞结构：锥体细胞呈椭圆型，核染色质疏松，核仁清楚;②神经细胞损伤：胞体缩小，呈三角形或长条形，

8、胞核固缩深染，核仁消失，细胞与周围间隙增宽。　　2.3神经症状评分从缺氧开始观察24h，观察异常神经症状并进行评分。评分标准[4]:竖毛震颤，运动减少各计1分;瘫痪、旋转、抽搐各计3分;昏迷计6分。结果见表1。A组无神经系统症状，而B组出现明显神经系统症状(P<0.05)，B组各亚组与A组相比均有显著性差异(P<0.05)，以Bb及