api2靶向抑制pi3k-akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究

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1、API2靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究【摘要】目的研究蛋白激酶B抑制剂2（API2）靶向抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，从而对胃癌细胞生长的影响。方法使用API2处理人胃癌细胞株SGC7901。MTT法检测0,2,4,6,8μmol/LAPI2作用不同时间对细胞增殖的影响；荧光染料AO/EB染色观察不同浓度API2作用24h后细胞凋亡情况；流式细胞仪检测细胞周期变化；).TheexpressionofpAKTandNFκBol/L)significantlyinhibitedth

2、eproliferationofSGC7901cellsindoseandtimedependentmanner.I1640（美国GIBCO公司），API2（德国MerckCalbiochem公司），四甲基偶氮唑蓝[3（4、5dimethylthiazol2YL）2，5diphenyltetrazoliumbromide，MTT]与二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（美国Amresco公司），兔抗人pAKT1/2/3（Ser473）多克隆抗体、鼠抗人NFκB（p65）单克隆抗体（美

3、国SantaCruz公司），I1640培养基中，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，按常规胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。使用不同浓度API2处理人胃癌细胞株SGC7901，以未使用API2处理的SGC7901细胞为对照。　　1.2.2增殖抑制实验　　SGC7901细胞以每孔5×103接种于96孔培养板中。API2用DMSO溶解，并调整DMSO终浓度为0.06％。用0,2,4,6,8μmol/LAPI2分别处理细胞24,48,72,96h后，加入MTT作用5h。离心，弃上清液，加入DMSO振荡溶解

4、后，用酶联免疫检测仪于490nm波长读取吸光度值，计算增殖抑制率。以上实验重复3次。增殖抑制率=[（对照组吸光度值实验组吸光度值）/对照组吸光度值]×100％　　1.2.3吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色（AO/EB）测定细胞凋亡　　细胞以每孔5×105接种在6孔培养板中，用0,4μmol/LAPI2分别作用24h，胰酶消化，离心收集细胞，PBS悬浮细胞2次，取100μLPBS稀释的细胞悬液，加2μL的AO/EB染色液，各含100μg/mL，30s后观察照相。随机计取5个视野共100个细胞中凋亡细胞百分数。实验重复3次。　　凋亡率

5、=总凋亡细胞数/细胞总数×100％　　1.2.4流式细胞仪分析细胞周期的影响　　对数生长期细胞用0,2,4,6,8μmol/LAPI2分别作用24h，用胰酶消化后，收集2×106细胞，预冷PBS洗涤1次，加入70％乙醇4℃固定过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤2次后加入RNA酶（1mg/mL）240μL，37℃水浴30min后，加入PI综合染液（PI浓度为124μg/mL，TritonX100浓度为0.124％）1mL，4℃避光染色30min，流式细胞仪进行检测。实验重复3次。　　1.2.5SIgG或GoatantiRabbit

6、IgG）孵育2h，漂洗后用ECL化学发光试剂盒进行检测。实验重复3次。结果进行灰度扫描后，QuantityOne分析软件测定平均光密度，并以GAPDH为内对照，计算pAKT（Ser473）、NFκB（p65）的相对表达量。　　1.3统计学处理　　数据均采用中位数±四分位间距[M±（QR）]表示，用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，对照组与各实验组之间分别行Mannan相关分析。　　2结果　　2.1API2对SGC7901细胞增殖的影响　　2～8μmol/LAPI2可以抑制SGC7901细胞增殖，并呈明显浓度和时间

7、依赖性（图1）。　　22.2API2对SGC7901细胞凋亡的影响　　不同浓度API2作用24h后，荧光显微镜下观察实验组中可见较多凋亡及坏死细胞，而对照组中大部分为活细胞，其胞膜完整，染色质分布均匀，呈均匀弥散绿色荧光（图2）。凋亡率实验组为13.2％，对照组为6.8％。　　2.3API2对SGC7901细胞周期的影响　　不同浓度API2作用24h后，与对照组相比，在G1期，2,4μmol/L组与对照组的差别均有统计学意义（P＜0.05）；在G2期，各实验组与对照组的差别均有统计学意义（P＜0.05），在S期，各实验组

8、与对照组的差别均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。表1不同浓度API2作用24h对SGC7901细胞周期的影响（略）　　2.4API2对SGC7901细胞pAKT（Ser473）、NFκB（p65）蛋白表达的影响　　与对照组相比较，4、8μmol/L