靶向抑制pi3k-akt信号通路对smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响

《靶向抑制pi3k-akt信号通路对smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、靶向抑制PI3K/Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响作者：石松菁,黄昌明石松长【摘要】　　目的研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子（Smac）基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响。方法将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002加入胃癌细胞株SGC7901,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖,DNAladder检测细胞凋亡,原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,免疫组织化学检测Smac的表达。结果LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关。在DNA电泳图上,对照

2、组呈规则的基因组断裂条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。流式细胞结果显示LY2940002处理后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,作用12h时,细胞凋亡达58.7%。Smac在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达；LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染。结论PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系密切。【关键词】1磷脂酰肌醇子激酶；线粒体蛋白质类；胃肿瘤；肿瘤细胞,培养的；细胞凋亡　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高,其异常的细胞凋亡和增殖在胃癌的形成和进展中具有重要意义。近年研究发

3、现,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的线粒体激活因子(secondmitochondriaderivedactivatorofcaspases,Smac)是一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白,能增加Caspase3活性,促进细胞凋亡[1]。笔者拟通过LY294002靶向抑制胃癌细胞SGC7901来探讨PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞株胃癌细胞系SGC7901由本实验室传代培养,含10%小牛血清(美国SIGMA公司)的RPMI1640培养基,在3

4、7℃培养箱中培养,2～3d更换培养基1次　　1.1.2实验试剂Smac多克隆抗体(美国SantaCruz公司)；PI3K抑制剂LY294002（美国Promega公司）；流式细胞仪（Coulter,EpicusELITE,ESP,美国)。　　1.2方法　　1.2.1LY294002溶液的配置按照配制说明书先将LY294002干粉5mg充分溶解于二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶液325μL中,配制成50mmol/L的LY294002溶液,移入-20℃冰箱储存,用前稀释成所需的浓度。　　1.2.2四甲基偶氮唑蓝（MTT

5、）法检测细胞生长活性选择对数生长期细胞,接种于96孔培养板,另设不加细胞的培养液为对照组。实验组分别给予终浓度为10,30,50μmol/L的LY294002（DMSO≤0.05%）,对照组加入同等浓度的DMSO,每孔设3个复孔。再培养4,8,12h,每孔分别加入5g/L的MTT10μL。加DMSO100μL,振荡。用酶标仪在波长490nm处测每孔光吸收值（D）,重复3次。计算：　　细胞存活率（%）=D试验组/D对照组×100%。　　根据MTT结果选择出干预浓度和时间。　　1.2.3DNALadder检测收集各组细胞,用PBS重悬,加入细胞裂

6、解液(1%NP40,20mmol/LEDTA,50mmol/LTris)400μL,反应10min,离心收集上清,加入十二烷基硫酸钠(SDS)至1%浓度,加入RNA酶在56℃作用1h,加入蛋白酶K37℃处理过夜,乙醇沉淀DNA,TE溶解DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并拍照。　　1.2.4原位细胞凋亡检测技术（TUNEL）检测细胞凋亡将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,取对数生长期细胞。待细胞长满后,给予终浓度为10,30,50μmol/L的LY294002（DMSO≤0.05%）,分别培养4,8,12h后,取出盖玻片,用4%多聚甲醛溶

7、液固定,并与阻断剂室温孵育30min。PBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2min。滴加TUNEL反应混合溶液50μL,在湿盒中37℃孵育。加入转化剂(POD)50μL,在37℃湿盒中孵育30min。加入DAB底物溶液50～100μL，封片,在光镜下分析结果：　　细胞凋亡指数=凋亡细胞数倒置显微镜计数200个细胞　　1.2.5流式细胞仪检测调整待测细胞的密度。设置对照组及观察组。收集细胞,70％冷乙醇固定24h,10μg/mLRNaseA37℃温育30min后,加碘化丙啶(PI)使其终浓度达20μg/mL,暗处作用＞0.5h。　　1.2.6胃癌细

8、胞SGC7901Smac表达的检测将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,当盖玻片面上的细胞长至70%～80%融合时,加入终浓度为50μmol/L的LY294002,不加