zac基因在生长抑素抑制胃癌细胞生长通路作用

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月同学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或

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3、的不良反应。因此，寻找更多基因治疗的靶点对提高胃癌的治疗水平及患者的生存率成为临床研究的热点。调控细胞周期阻滞和细胞凋亡的锌指蛋白(zincfingerproteinwhichregulatesapoptosisandcellcyclearrest，ZAC)为一种转录因子，具有转录活化活性和DNA结合功能，可诱导细胞凋亡和细胞Gl期阻滞，从而抑制肿瘤细胞生长。前期的研究表明胃癌组织ZAC基因及生长抑素(somatostatin，SST)表达均下调，且二者呈明显正相关，参与胃癌的发生。为观察SST是否可诱导胃癌细胞ZAC基因的表达，本研究观

4、察了SST类似物奥曲肽(octreotide，OCT)对胃癌细胞系BGC823和SGC7901ZAC基因表达的效应；为评定ZAC基因在SST抑制胃癌细胞生长通路的作用，本实验应用RNA干扰技术建立了ZAC基因敲低(knock—down)胃癌细胞系(ZAC—KD)，观察ZAC基因沉默后OCT孵育对胃癌细胞的生长抑制作用及细胞凋亡的作用。方法1．MTT法筛选OCT作用的最佳条件用lnmol／L、1Onmol／L、1OOnmol／L和1000nmol／L的OCT孵育胃癌细胞系BGC823及SGC7901，分别于12h、24h和48h后，应用MT

5、T技术检测生长抑素对胃癌细胞增殖效应，筛选OCT抑制胃癌细胞增殖最佳作用浓度和作用时间。2．OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应以最佳浓度和时间OCT孵育胃癌细胞系BGC823和SGC7901，应用Westernblot检测OCT对胃癌细胞ZAC基因表达的效应。摘要3．构建ZAC—shRNA表达载体根据ZAC基因在GenBank中所查到的mRNA序列，通过在线设计和同源性比较确定3条靶向ZAC基因的siRNA序列，交由生物公司合成互补性发卡样寡核苷酸。退火形成双链后，插入pSUPER—EGFP—I质粒中，构建3个ZAC．shRNA表达载体：p

6、SUPER．EGFP．Z1、pSUPER．EGFP．Z2和pSUPER．EGFP．Z3。HindlII／EcoRI双酶切及序列分析鉴定。4．建立ZAC．KD胃癌细胞系转染前胃癌细胞系BGC823和SGC7901的培养体系采用无抗牛素培养基。各质粒提取均采用无内毒素质粒提取试剂盒。分实验组(分别转染质粒pSUPER．EGFP．Z1、pSUPER．EGFP—Z2和pSUPER．EGFP．Z3)、实验对照组质粒(转染质粒pSUPER．EGFP．I)和对照组(无质粒转染)。应用脂质体LipofectamineTM2000转染，G418选择性筛选近

7、3周。RT．PCR技术检测ZACmRNA水平，建立ZAC基因敲低的BGC823细胞系和SGC7901细胞系，分别命名为ZAC．KD／BGC823和zAC．KD／sGC7901。5．OCT孵育对ZAC．KD胃癌细胞系细胞增殖及细胞凋亡的效应以最佳浓度和时问OCT孵育胃癌细胞系BGC823、ZAC．KD／BGC823、SGC7901和ZAC—KD／SGC7901，应用MTT法和流式细胞技术观察OCT对胃癌细胞增殖和细胞凋亡的效应。6．统计学处理所有数据以均数4-标准差(X±S)表示，应用SPSSll．5统计软件处理数据，P

8、著性。结果1．OCT作用最佳条件MTT结果显示，OCT对胃癌细胞的增殖抑制效应具有浓度和时间依赖性；10nmol／L，作用24h，OCT对胃癌细胞系BGC823和SGC7901的增殖抑制效应最