smad4基因rnai慢病毒载体的构建与鉴定论文

《smad4基因rnai慢病毒载体的构建与鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定论文季国忠，张发明，翟惠虹，范志宁，樊代明，王学浩【关键词】慢病毒ConstructionandidentificationoflentiviralvectorofRNAinterferenceofSmad4gene【Abstract】AIM:ToconstructalentiviralvectorofRNAinterference(RNAi)ofSmad4gene.METHODS:TheeffectivesequenceofsiRNAtargetingSmad4geneedinourpreviousstudy.TheplementaryDNAc

2、ontainingbothsenseandantisenseOligoDNAofthetargetingsequenceoterandgreenfluorescentprotein(GFP).TheresultinglentiviralvectorcontainingSmad4shRNAedLVshSmad4,anditedbyPCRandsequencing.293Tcellsad4，pCMVdR8.74andpMD2G.Allvirusstocksphosphatemediatedtransfection.Thetiterofvirusonstratedthatthelentiviru

3、sRNAivectorofSmad4(LVshSmad4)producingSmad4shRNAad4ad4;Neoplasms;Lentivirus【摘要】目的：构建Smad4基因RNAi慢病毒载体.方法：针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNAlentivectors.php）.该病毒包装系统由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G3质粒组成，其中pLVTHM含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达绿色荧光蛋白（GFP）.pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包装所必须的元件.限制性内切酶、T4DNA连接酶、大量质粒DNA提取试剂盒（Q

4、iagen公司).1.2方法1.2.1构建表达shRNA慢病毒载体用Ambion公司的设计软件，设计、合成3对针对Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列.经分别构建质粒，转染293细胞，据其对Smad4的抑制率，确定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4mRNA第1848位，GenBankgi：34147555）.设计并合成（上海吉凯基因化学技术公司）其shRNA的DNAOligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGATCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（内含MluI和ClaI酶切位点，

5、下划线所示.tronolab.lentivectors.php）.经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，转化DH5大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定（上海博亚生物技术有限公司）.PCR鉴定阳性克隆的primer:Up:5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；DoL的细胞培养皿，37℃，50mL/LCO2培养箱内培养，细胞密度达60%～70%时转染.制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液（LVshSmad420μg，pCMVdR8.7415μg，pMD2G7.5μg），无菌水定容至1800μL,再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液

6、200μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20～30min.将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS15mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.然后每瓶细胞中加入含100mL/L小牛血清的细胞培养液15mL，继续培养48h.收集转染72h的293T细胞上清液.于4℃，4000g离心10min；以0.45μm滤器过滤后置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解过夜.次日，以10μL每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存.DMEM培养液重悬293T细胞

7、至5×108/L,在96孔板每孔中加100μL重悬细胞.取6个eppendorf管，每管中加入90μL预热的OptiMEM培养基,加10μL病毒颗粒于第1管，混匀，从第1管取10μL混合液于下一管，混匀；依次稀释病毒颗粒至第6管；将96孔板中培养基吸出，每孔加45μL病毒颗粒稀释液，37℃温育8h后，更换含100mL/LFBS的培养液继续培养.倒置荧光显微镜下检测GFP表达量，计算病毒滴度.2结果2．1阳性克隆的PCR鉴