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时间:2018-11-19
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1、大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征【摘要】目的研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(H4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。方法利用脂质体介导大鼠H4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体,转染HEK293细胞进行扩增,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测H4mRNA表达,采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上H4电流。结果大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞,记录到一系列超极化内向离子流,该电流呈电压、时间依赖性,没有明显的失活,在-150mV时电流幅值为(540±24
2、.1)pA,电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n=12),半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV,稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV,H4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV。结论应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道H4基因的异源性表达。【关键词】超极化激活环核苷酸门控阳离子通道;异源性表达;膜片钳;大鼠 Abstract:ObjectiveToexplorethecurrentcharacteristicsandexpressionofH4myocytesinratventricularmyocytesintoH
3、EK293.MethodsTheH4genefragmentidpTracer-CMV-GFPtoformthetransfervector.ThemRNAexpressionethodafterbEingtransfectedintotheHEK293cellusingLipofactamine2000reagentforamplification,thentouseprecordingthecurrent.ResultsAninH4channelbegantoactivateinvoltageandtimedependentmanneraxi
4、malactivation(V1/2)V,(-105.7±12.0)mV,respectively.ConclusionH4geneissuccessflyheterologouslyexpressedbythemethodofLipofactaminetransfected. Keyprecordings;rat心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自动除极最主要电流之一,起搏电流(pacemakercurrent,If)无论在自律细胞的起搏[1],还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因
5、家族在鼠和人类已经被克隆[2-3],分别是H1~H4,超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(H)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础,起博电流表现为广泛的区域电压依赖性,心脏主要表达H2和H4[4],在窦房结的H含量最高,H4是绝对优势的亚型,占总HmRNA的80%以上。HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞,贴壁生长,能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。本实验应用含目的基因H4和携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染[5],通过瞬时表达进行检测,结合膜片钳技术
6、记录转染细胞后的mH4通道电流的特征。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1质粒和主要试剂 携带大鼠心室肌起搏通道亚型mH4/pTracer-CMV质粒由美国西弗吉尼亚大学的Han-GangYu博士惠赠;脂质体转染试剂采用LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;高糖DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;QuickprepTMMicromRNApurification试剂盒购自pharmacia公司。 1.1.2主要仪器 膜片钳放大器:Axopatch700BAxonInstrument
7、s,USA;数模转换器:DigiData1320AxonInstruments,USA;垂直微电极拉制仪:ModelPP-830(NARISHIGE,日本);荧光显微镜(Olympus,日本)。 1.1.3溶液的配制 电流记录的电极外液(mmol/L):MgCl25.0,KCl130,Na2ATP45.0,EGTA11.0,HEPES10.0,Glucose5.6,pH值用KOH调至7.2;记录电流的电极内液成分(mmol/L):KCl5.4;NaCl143,CaCl21.8,MgCl20.5,NaH2PO40.25;HEPES5.0;葡萄糖
8、5.6;pH用NaOH调至7.3。 1.2方法 1.2.1mH4基因瞬时转染HEK293细胞 细胞培养用高糖DMEM培养基,含10
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