大鼠心室肌hcn4质粒在hek293细胞的表达及

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1、大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及【摘要】目的研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(H4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。方法利用脂质体介导大鼠H4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体，转染HEK293细胞进行扩增，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测H4mRNA表达，采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上H4电流。结果大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞，记录到一系列超极化内向离子流，该电流呈电压、时间依赖性，没有明显的失活，在-150mV时电流幅值为(

2、540±24.1)pA，电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12)，半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV，H4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV。结论应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道H4基因的异源性表达。【关键词】超极化激活环核苷酸门控阳离子通道；异源性表达；膜片钳；大鼠　　Abstract:ObjectiveToexplorethecurrentcharacteristicsandexpressionofH4myocytesinratventricu

3、larmyocytesintoHEK293.MethodsTheH4genefragmentidpTracer-CMV-GFPtoformthetransfervector.ThemRNAexpressionethodafterbeingtransfectedintotheHEK293cellusingLipofactamine2000reagentforamplification，thentouseprecordingthecurrent.ResultsAninH4channelbegantoactivateinvoltag

4、eandtimedependentmanneraximalactivation（V1/2）V,（-105.7±12.0）mV,respectively.ConclusionH4geneissuccessflyheterologouslyexpressedbythemethodofLipofactaminetransfected.　　Keyprecordings；rat心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自动除极最主要电流之一，起搏电流(pacemakercurrent，If)无论在自律细胞的起搏［

5、1］，还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆［2-3］，分别是H1～H4，超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(H)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础，起博电流表现为广泛的区域电压依赖性，心脏主要表达H2和H4［4］，在窦房结的H含量最高，H4是绝对优势的亚型，占总HmRNA的80%以上。HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，贴壁生长，能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。本实验应用含目的基因H4和携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒

6、表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染［5］，通过瞬时表达进行检测，结合膜片钳技术记录转染细胞后的mH4通道电流的特征。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1质粒和主要试剂　　携带大鼠心室肌起搏通道亚型mH4/pTracer-CMV质粒由美国西弗吉尼亚大学的Han-GangYu博士惠赠；脂质体转染试剂采用LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；高糖DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；QuickprepTMMicromRNApurification试剂盒购自ph

7、armacia公司。　　1.1.2主要仪器　　膜片钳放大器：Axopatch700BAxonInstruments，USA；数模转换器：DigiData1320AxonInstruments，USA；垂直微电极拉制仪：ModelPP-830(NARISHIGE，日本)；荧光显微镜(Olympus，日本)。　　1.1.3溶液的配制　　电流记录的电极外液(mmol/L)：MgCl25.0，KCl130，Na2ATP45.0，EGTA11.0，HEPES10.0，Glucose5.6，pH值用KOH调至7.2；记录电流的电极内液成分

8、(mmol/L)：KCl5.4;NaCl143，CaCl21.8，MgCl20.5，NaH2PO40.25;HEPES5.0;葡萄糖5.6;pH用NaOH调至7.3。　　1.2方法　　1.2.1mH4基因瞬时转染HEK293细胞　　细胞培养用高糖DMEM培养基，含10%胎牛血