大鼠心室肌hcn4质粒在hek293细胞的表达及电流特征

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1、大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征【摘要】目的研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。方法利用脂质体介导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体，转染HEK293细胞进行扩增，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCN4mRNA表达，采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上HCN4电流。结果大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞，记录到一系列超极化内向离子流，该电流呈电压、时间依赖性，

2、没有明显的失活，在-150mV时电流幅值为(540±24.1)pA，电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12)，半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV，HCN4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV。结论应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达。【关键词】超极化激活环核苷酸门控阳离子通道；异源性表达；膜片钳；大鼠　　Abstract:ObjectiveToexplorethecurrentcharacteristicsan

3、dexpressionofHCN4myocytesinratventricularmyocytesintoHEK293.MethodsTheHCN4genefragmentwasclonedintotheshuttleplasmidpTracer-CMV-GFPtoformthetransfervector.ThemRNAexpressionwasdetectedbyreverse12transcriptase-PCRmethodafterbeingtransfectedintotheHEK293cellu

4、singLipofactamine2000reagentforamplification，thentousewholecellpatchclamprecordingthecurrent.ResultsAninwardcurrentwasrecordedinresponsetohyperpolarizationactivatonintransfectedHEK293cellThemHCN4channelbegantoactivateinvoltageandtimedependentmannerwithoutd

5、eactivationthresholdvoltageandpotentialofhalf-maximalactivation（V1/2）was-70mV,（-105.7±12.0）mV,respectively.ConclusionHCN4geneissuccessflyheterologouslyexpressedbythemethodofLipofactaminetransfected.　　Keywords:hyperpolarizationactivatedcyclicnucleotidegated

6、cationchannel；heterologouslyexpressed；patchclamprecordings；rat心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。作为组织自动除极最主要电流之一，起搏电流(pacemaker12current，If)无论在自律细胞的起搏［1］，还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆［2-3］，分别是HCN1～HCN4，超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础，起博

7、电流表现为广泛的区域电压依赖性，心脏主要表达HCN2和HCN4［4］，在窦房结的HCN含量最高，HCN4是绝对优势的亚型，占总HCNmRNA的80%以上。HEK293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，贴壁生长，能转运多数核苷酸翻译后的成熟蛋白。本实验应用含目的基因HCN4和携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的质粒表达载体pTracer-CMV-GFP进行共转染［5］，通过瞬时表达进行检测，结合膜片钳技术记录转染细胞后的mHCN4通道电流的特征。　　1材料与方法　　1.1材料　

8、　1.1.1质粒和主要试剂　　携带大鼠心室肌起搏通道亚型mHCN4/pTracer-CMV质粒由美国西弗吉尼亚大学的Han-GangYu博士惠赠；脂质体转染试剂采用LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；高糖DMEM培养基、10%胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；QuickprepTMMicromRNApurification试剂盒购自pharmacia公司。　　1.1.2主要仪器