体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌单个心肌细胞获取方法的建立

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1、体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌单个心肌细胞获取方法的建立作者：于长海，刘颖，李捷，张宜明，俞建琦【摘要】目的：探讨体外分化的小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞获取方法.方法：用胰酶、胶原酶溶液消化乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞，获得细胞悬液经Percoll分离纯化后，再低密度接种富集的心肌细胞，通过光镜观察获得的单个跳动的心肌细胞，采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞.结果：乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞用胰酶、Dispase酶消化，经Percoll分离纯化后，能获得纯的单个心肌细胞，光镜下单个心肌细胞收缩明显而有力.免疫组织化学和激光

2、共聚焦观察发现单个心肌细胞中有肌原纤维束.结论：使用胰酶、Dispase酶消化后，经Percoll分离纯化可从体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织获得活性良好的单个心肌细胞.【关键词】小鼠;胚胎;干细胞；心肌/细胞学；细胞培养技术　　【Abstract】AIM：Tofindamethodtogetsinglecardiomyocytefrommouseembryonicstemcells(mEScells)differentiatedinvitroandneonatalratventriculartissues.METHODS:Neonatalratventriculartiss

3、uesanddifferentiatedmouseembryonicstemcellsyocytesyocytesicroscopeandimmunohistochemistryandconfocallaserscanningmicroscopy(CLSM).RESULTS:AfterdiscontinuousPercollgradientcentrifugation,theenrichedcardiomyocytesyocytebeatspontaneouslyunderlightmicroscope.andexhibitedstrandsofelongatedandyofibri

4、ls.CONCLUSION:ThismethodcouldgetsinglecardiomyocyteorphologyandvitalityfromdefferentaitedmEScellsandneonatalratventriculartissues.　　【Keyicembryo;stemcells;myocardrum/cytology;cellculturetechniques　　0引言　　目前，由于缺少能模拟心肌细胞发育的心肌细胞系,并且早期胚胎心脏太小,心肌细胞是怎样由它的前身细胞分化而来，心肌基因表达及不同离子通道的功能表达之间的关系以及形态和离子通道调控变化的关系

5、等研究受到阻碍.随着胚胎干细胞的研究及技术发展,以上各项研究都可利用从多能小鼠胚胎干细胞在体外分化成心肌细胞的模型加以研究.我们将介绍体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞的获取方法.　　1材料和方法　　1.1材料　　复苏mES细胞（ESD3细胞）、FBS（购自北京元亨圣马生物技术研究所）；谷胺酰胺、庆大霉素、β巯基乙醇、非必需氨基酸、胶原酶溶液（Dispase酶）（均购自Sigma公司）；旋转生物反应器（RotaryCellCultureSystem，RCCS）；抗心肌肌钙蛋白T抗体（1∶100）、抗大鼠IgG（购自博士德公司）；生物素标记的羊抗小鼠试剂盒（购自中

6、杉金桥公司）；辣根标记的链霉卵白素、DAB试剂盒（购自中山试剂公司）.　　1.2方法　　1.2.1未分化mES细胞的培养复苏mES细胞(ESD3)，离心弃去DMSO培养液,于ES细胞未分化培养液，即150mL/LFBS，2.2g/LNaHCO3，2mmoL/L谷胺酰胺，庆大霉素4万U/L，0.1mmoL/Lβ巯基乙醇,0.01mmoL/L非必需氨基酸,100万U/LLIF(Gibco)的HDMEM中重悬，接种到丝裂霉素C处理过的、已经失去有丝分裂活性的滋养层细胞的3cm培养皿中，每皿完全培养基5mL.细胞密度约1×109/L.37℃,50mL/LCO2培养箱中培养，第2日更换培

7、养液，继续培养.　　1.2.2mES细胞的分化培养　　1.2.2.1旋转生物反应器制备拟胚体（EBs）取对数生长期小鼠胚胎干细胞（ESC），经2.5g/L胰酶+0.4g/LEDTA消化后制备为细胞悬液，细胞计数后以107/L细胞密度种植入经无菌处理的容量为110mL的RCCS（STLV型）内，并补充培养基至充满整个容器.将整个装置置于CO2培养箱内，37℃条件下常规培养.RCCS的初始转速为10r/min，随着EBs的形成及其体积的不断增加，调节转速至15