论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响论文

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1、论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响论文.freelieon公司；兔抗GFAP购自武汉博士德公司；兔抗MAP-2单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。1.2动物分组与视神经离断模型取3个月龄sD大鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组：正常对照组、假手术组和视神经离断组，每组动物均为10只。视神经离断组大鼠随机选择一侧眼，在手术显微镜下钝性分离显露视神经；在离后极约2mm处剪断视神经。术后于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验。假手术组动物外科操作同视神经离断组，但不离断视神经。正常对照

2、组则不做任何处理。1.3胚胎上丘NSCS的分离与培养取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕龄的计算方法为：将雌雄大鼠合笼后，次晨检查发现阴栓者为孕0天。按照大鼠脑解剖图谱细心分离出上丘组织。胚胎上丘NSCS的分离与原代培养程序参见冯东福等已建立的方法。1.4单细胞克隆及鉴定将第2代的神经干细胞球，吹打成单细胞悬液。使用连续稀释法，最终细胞密度为100／ml。参照Reynolds和AP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根据不同的一抗选择FITC或Cy3荧光二抗。阴性对照使

3、用PBS液代替一抗。对Thyl.1阳性的培养孔，每孔随机选择3个克隆，在细胞疏松区域选择4个不同视野，记数总细胞数和Thyl.1阳性细胞数，计算阳性率。2结果2.1上丘神经干细胞克隆形成及鉴定大鼠胚胎上丘细胞接种48h后培养液明显黄变，大部分细胞死亡，存活的部分细胞胞体增大，折光性增强，伴有明显光晕。部分细胞出现分裂相，细胞可成对出现。随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，呈球形悬浮生长，边缘细胞折光性较强。对第2代细胞进行单细胞克隆培养后发现，细胞可形成亚克隆，这些来自单个细胞的亚克隆可以进行传

4、代培养，并大量增殖。使用激光共聚焦显微镜，进行三维重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin阳性，中心的细胞较为2.2分化细胞的鉴定NSCS的自然分化和各共培养组合诱导分化分化情况。各组神经干细胞大部分均分化为GFAP阳性的神经胶质细胞。少量分化为MAP-2阳性的神经元。但只有上丘源NSCS与视神经离断组的上丘组织共培养后可见有Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞分化。在该组分化的细胞中，Thyl.1阳性细胞的比率为14.92％2.3神经干细胞的自然分化神经干细胞克隆在撤除丝裂原24h后贴壁。随着时

5、问延长克隆球逐渐变扁平，并以克隆为中心产生放射状细胞迁移。克隆球边缘的细胞形状较不规则，多数细胞呈梭形或多角形，发出短而细的突起。7d后部分细胞可见长突起，细胞的折光性也各有不同。在相差显微镜下可见胞体较疏松，边缘部分有散在的迁移细胞，部分细胞可见有突起发出，亦呈Nestin阳性。大、形态不规则、具有多个粗突起的胶质样细胞数量较多。而胞体有很强光晕，呈圆形或椭圆形、具有1～2个细长突起的神经元样细胞数量较少。随着神经干分化时间的延长，克隆球四周的细胞逐渐增多，迁移的距离也逐渐增加。在培养2周时出

6、现大量细胞迁移，而克隆球边缘则逐渐模糊2.4组织-神经干细胞共培养诱导分化上丘神经干细胞经与组织共培养24h后均贴壁生长，克隆球逐渐变扁平。部分克隆球边缘有细胞突起发出，开始分化过程。在培养48h后可见细胞向外迁移，在相差显微镜下呈明显的“太阳征”在培养5d时，以克隆为中心产生的3讨论虽然干细胞的体外诱导分化已经有较多研究，但在体外诱导NSCS向RGCs分化，特别是采用上丘组织与NSCS共培养诱导分化的研究目前还未见报道。笔者采用了一种新型的双室共培养诱导NSCS分化模式，细胞与组织不在一个平面

7、上。下室为多聚赖氨酸包被的培养板，用于细胞培养。上室底部的PET膜使用细胞外基质包被，并经过蚀刻处理，有利于细胞的迁移，其组织贴壁率明显优于传统培养载体。组织接种到小室底部PET膜上后，与下室组合在一起进行共培养。由于PET膜上分布的孔径为0.4μm，所以膜上细胞分泌的分子会穿过PET膜孔到达下面，但细胞却无法进行直连续放射状细胞迁移，这些细胞的形态大多是圆形或梭形，多数细胞有较长突起，也有一些细胞体未见明显突起长。在培养2周后，大部分克隆明显减小，而不同克隆分化出的细胞交织成网，细胞间的突起相

8、互连接。接接触，因此可以排除细胞接触因素的影响。在哺乳动物中枢神经系统的发育过程中，各种神经元与对应的靶组织建立突触联系往往是其存活和进一步成熟分化的重要条件。大鼠出生时视觉系统尚未成熟，视网膜神经细胞，特别是节细胞，在出生后的成熟和分化，皆有赖于其靶组织一中脑上丘提供神经营养和诱向因子。因此笔者通过将NSCS与RGCS的靶组织共培养的方法，探讨靶组织在体外环境下对NSCS分化的影响。笔者发现视神经离断成年大鼠的上丘组织均可诱导NSCS分化为RGCS，而假手术组和正常对照组的上丘组织则无此作用。