甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中fhit基因的调控

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1、甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控.L.编辑。【摘要】目的探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制。方法培养宫颈癌细胞C33A、HeLa、CasKi、SiHa及人脐静脉血管内皮细胞ECV304，进行5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的甲基化分析，并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的表达。结果4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化，正常对照细胞ECV304在5azadC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物。

2、4株宫颈癌细胞在5azadC化学干预前均未见明显FHIT的荧光着色，而干预后的细胞胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在106M及2×106M干预浓度下的表达最强(P<0.05)；干预48h、72h后FHIT的表达与干预24h的类似。ECV304细胞在5azadC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异(P>0.05)。结论FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，甲基化可能是FHIT基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。【关键词】脆性组氨酸三联体基因（FHIT）；人宫颈

3、癌细胞系；5azadC；DNA甲基化；免疫荧光　　PatternofFHITGene5’CpGIslandMethylationContributetoHumanCervicalCarcinomaCellTumorigenesis　　Abstract：ObjectiveTodetermineethylationofFHITplayedanimportantroleincervicaltumorigenesis.MethodsByincubatingDNAinthepresenceofamethylase,ethylatio

4、nofFHITinfourcervicalcancercelllinesandonehumanumbilicalvEinendothelialcelllinetreatingethyltransferaseinhibitor,5aza2'deoxycytidine(5azadC).TheexpressionofFHITonitoredbyRTPCRandimmunofluorescencetechniquebeforeandafter5azadCtreatment.ResultsI1640培养液，37℃，5％

5、CO2培养，其余细胞均用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。　　1.25azadC化学干预5azadC购自Sigma公司，干预时用培养基稀释为0M，5×１0-7M，10-6M，2×10-6M，5×10-6M，10-5M的工作浓度。接种对数生长期的细胞2×10-5/60mm培养皿，培养24小时后以上述工作浓度的5azadC进行化学干预。再培养24h和72h后，收集细胞。　　1.3基因组DNA的提取参照姜泊[2]所著《分子生物学常用实验方法》提取高分子量细胞基因组DNA，在紫外分光光度计上测定DNA浓度和纯度，OD2

6、60/OD280的比值在1.8～2.0之间为合格。　　1.4甲基化分析采用甲基化酶温育法,用10U甲基化敏感酶HpaⅡ将1μg基因组DNA37℃酶切过夜，以使其完全消化；同时用10U非甲基化敏感酶MspⅠ完全消化基因组DNA为对照。然后进行PCR扩增FHIT基因，引物序列及PCR反应条件参照　　M:100bp的DNAMarker1:5azadC的浓度为0M2：5azadC的浓度为5×10-7M3：5azadC的浓度为10-6M4：5azadC的浓度为2×10-6M5:5azadC的浓度为5×10-6M6:5

7、azadC的浓度为10-5M　　图1不同浓度的5azadC作用于CasKi细胞24h和72h后的FHITmRNA水平的变化（略）　　M:100bp的DNAMarker1:5azadC的浓度为0M2：5azadC的浓度为5×10-7M3：5azadC的浓度为10-6M4：5azadC的浓度为2×10-6M5:5azadC的浓度为5×10-6M6:5azadC的浓度为10-5M　　图2不同浓度的5azadC作用于ECV304细胞24h和72h后的FHITmRNA水平的变化（略）　　2.3免疫荧

8、光检测5azadC化学干预前后各株细胞中FHIT的表达5azadC化学干预前4株宫颈癌细胞均未见明显FHIT的荧光着色，经过5azadC化学干预后，4株细胞的胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在10-6M及2×106M干预浓度下的表达最强；干预48、72