甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中fhit基因的调控论文

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1、甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控论文【摘要】目的探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制。方法培养宫颈癌细胞C33A、HeLa、CasKi、SiHa及人脐静脉血管内皮细胞ECV304，进行5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的甲基化分析，并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的表达。结果4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化，正常对照细胞ECV304在5azadC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物。4株宫颈癌细胞在5azad

2、C化学干预前均未见明显FHIT的荧光着色，而干预后的细胞胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在106M及2×106M干预浓度下的表达最强(P0.05)；干预48h、72h后FHIT的表达与干预24h的类似。ECV304细胞在5azadC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异(P0.05)。结论FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，甲基化可能是FHIT基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。【关键词】脆性组氨酸三联体基因（FHIT）；人宫颈癌细胞系；5azadC；DNA甲基化；免疫荧光Patternof

3、FHITGene5’CpGIslandMethylationContributetoHumanCervicalCarcinomaCellTumorigenesisAbstract：ObjectiveTodetermineethylationofFHITplayedanimportantroleincervicaltumorigenesis.MethodsByincubatingDNAinthepresenceofamethylase,ethylationofFHITinfourcervicalcancercelllinesandonehumanum

4、bilicalveinendothelialcelllinetreatingethyltransferaseinhibitor,5aza2'deoxycytidine(5azadC).TheexpressionofFHITonitoredbyRTPCRandimmunofluorescencetechniquebeforeandafter5azadCtreatment.ResultsI1640培养液，37℃，5％CO2培养，其余细胞均用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。1.25azadC化学干预5azadC购自Sigm

5、a公司，干预时用培养基稀释为0M，5×１0-7M，10-6M，2×10-6M，5×10-6M，10-5M的工作浓度。接种对数生长期的细胞2×10-5/60mm培养皿，培养24小时后以上述工作浓度的5azadC进行化学干预。再培养24h和72h后，收集细胞。1.3基因组DNA的提取参照姜泊2所著《分子生物学常用实验方法》提取高分子量细胞基因组DNA，在紫外分光光度计上测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间为合格。1.4甲基化分析采用甲基化酶温育法,用10U甲基化敏感酶HpaⅡ将1μg基因组DNA37℃酶切过夜，以使

6、其完全消化；同时用10U非甲基化敏感酶MspⅠ完全消化基因组DNA为对照。然后进行PCR扩增FHIT基因，引物序列及PCR反应条件参照文献3。若出现FHIT基因的扩增产物，则证实甲基化存在。1.5逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）用TRIZOL试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪检测纯度和浓度，取2μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录，PCR扩增FHIT基因，并同时扩增GAPDH作内参照，引物由上海博亚生物公司合成；引物序列及PCR反应条件参照文献4。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察、拍照。1.6免疫荧光化学染色兔抗

7、人FHIT多克隆一抗试剂购自北京中山生物技术公司。细胞培养24h，再用上述工作浓度的5azadC进行化学干预，培养24h、48h和72h后，取出细胞爬片，PBS冲洗，冷丙酮固定，1%TritonX100室温作用20min，血清封闭，再分别加入兔抗人FHIT多克隆抗体，4℃过夜后，分别加入羊抗兔FITCIgG，37℃温育后封片。实验同时设PBS代替一抗的阴性对照。1.7统计学方法运用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析，采用t检验。2结果2.1宫颈癌中FHIT基因甲基化分析HapⅡ和MspⅠ为同裂酶，两者都可以切开CCGG序列；

8、而该序列甲基化为CmCGG时只有非甲基化敏感酶MspⅠ可切开，甲基化敏感酶HapⅡ的切割被阻断，由此差异可判断其甲基化情况