pkb-akt 调节结构域的克隆，表达及初步纯化论文

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1、PKB/Akt调节结构域的克隆，表达及初步纯化论文王立峰，张健，李莹，苏金，药立波，刘新平【关键词】基因表达【Abstract】AIM:ToclonethecodingsequencesofhumanRD(regulationdomainofPKB/Akt),toexpressthecorrespondingproteinandtogetthepurifiedprotein.METHODS：TheRDcDNA(regulationdomainofPKB/Akt)fragmentplifiedusingPCRinfetalhepatocytes.T

2、hePCRproductedbyparisonnbyvirtueofthe(His)6tagontheprotein.CONCLUSION：HumanRDofakt1genehasbeensuccessfullyclonedandRD/6×Hisrebinantplasmidconstructed.RD/6×HisfusionproteinhasbeencorrectlyexpressedinE.coliandthesolublefusionproteinpurifiedbyNi2NTAagarosebeads.【Keyolecular;gene

3、expression;purification【摘要】目的：克隆akt1的调节结构域(regulationdomainRD)的编码基因，表达并纯化AktRD蛋白，为研究RD的功能奠定基础.方法：用RTPCR方法从胚胎肝细胞中获得Akt1调节结构域RD的编码基因.freelain,RD）［１－３］.PKB/Akt参与某些生长因子或淋巴因子诱导的靶细胞应答，影响胞内糖类的转运、糖原的合成及蛋白质的合成，抑制细胞凋亡等，是机体维持正常生命活动的一个重要调节分子［４］.PKB/Akt催化结构域中的Thr308和调节结构域中的Ser473都发生磷酸化后，使

4、其活性被激活，进而调节下游分子，执行相应功能［５］.调节结构域中的Ser473的磷酸化对PKB/akt发挥最大活性至关重要［６］.催化结构域的Thr308的磷酸化是由上游的PDK1催化的［７，８］，而使位于调节结构区的Ser473发生磷酸化的激酶（即人为设想的PDK2）至今未找到明确的分子［９］.因此，克隆并纯化得到PKB/Akt的调节结构域，将为寻找PDK2分子及研究PKB/Akt分子的调节结构域对整个分子的调节作用奠定实验基础.1材料和方法1．1材料T4DNA连接酶购自TaKaRaBiotech公司；EcoRI,NheI限制性内切酶购自晶美生

5、物工程有限公司；AMV反转录酶购自Promega公司；pRSETA载体购自Invitrogen公司；金属螯合亲合层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qlagen公司；大肠杆菌BL21由本室冻存；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自华美公司；Akt单抗购自Cellsignal公司；HRP标记的兔抗鼠二抗购自SantaCruzBiotecknology；V逆转录酶合成第一条链cDNA.具体反应体系为：总RNA1μg与Oligo(dT)152μL,70℃,10min,然后加入5×RTBuffer5μL,.freelmol)2.5μL,RNaseinhi

6、biter1μL,AMV逆转录酶3μL,DEPC水9.5μL.42℃水浴1h,沸水浴5min，-20℃保存.取1μL逆转录产物为模板，在25μL反应体系中先将模板于95℃变性5min，加入16.67nkatTaqDNA聚合酶，在PE2400PCR循环仪中反应.循环参数：94℃30s,60℃40s,72℃30s,30cycles，于72℃延伸15min.用12gL１琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物.1．2.4DNA序列测定PCR扩增产物用上海华舜公司胶回收试剂盒回收，将回收的目的片段克隆到测序载体pMD18T中测序.1．2.5表达载体RDpRSETA的

7、构建用NheI/HindⅢ将RD从测序载体pMD18T中切下，插入pRSETA表达载体，构建出重组表达载体pRSETARD.1．2.6融合蛋白的表达时间及表达形式分析将重组质粒转化BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，在LB培养基中（0.1gL-1氨苄青霉素）培养过夜.取50μL菌液转接5mL含氨苄青霉素的LB中，待A600nm=0.6~0.8时加入IPTG至终浓度为1mmolL１诱导表达.每小时收一次菌（约1mL）.取第5小时的菌50mL，超声裂菌（输出频率为60Hz，4℃，5次，每次15s），离心（12500g，4℃，60min），取上清用0.4

8、5μm滤膜过滤，加入NaN3至0.2gL-1，存于4℃备用.分别取适量上清和沉淀及不同时间的总菌体进行SDSPAGE,分析目的蛋白质的不