丹参对糖尿病肾病大鼠肾脏水通道蛋白

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1、丹参对糖尿病肾病大鼠肾脏水通道蛋白作者：胡波范红伟，王燕午陈冰雪，王振国，李俊勇，李锋【摘要】　　目的探讨肾脏水通道蛋白-2(AQP-2)的表达与糖尿病肾病大鼠水液代谢异常及丹参防治作用的机制。方法60只健康SD大鼠分为正常组(10只)，剩余50只采用高糖高脂饲料刺激加小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型成功30只，随机分为模型组、对照组、观察组每组各10只；免疫组织化学检测AQP-2在各组大鼠肾脏中的分布及蛋白质的表达；RT-PCR方法检测各组大鼠AQP-2mRNA的表达，并以β-actin相对定量。结果肾脏免疫组化显示，AQP-2主要在肾脏的集合管表达。在4组动物的肾脏AQP-2蛋白质［相

2、对阳性面积：正常组(0.119±0.035)，模型组(0.188±0.027)，对照组(0.158±0.036)，观察组(0.154±0.033)］和mRNA［正常组(0．51±0．004)，模型组(0.81±0.059)，对照组（0.78±0.090），观察组（0.70±0.027）］的表达上观察组较模型组均下调（P＜0.01）。结论在糖尿病模型大鼠肾脏组织中AQP-2表达增多，AQP-2的增多可能参与了糖尿病多尿的形成。丹参对水通道蛋白的表达有下调作用，这可能是其利水作用的机制，也是其防治糖尿病肾病的基础。【关键词】糖尿病肾病；水通道蛋白；丹参；链脲佐菌素糖尿病肾病（diabetic

3、nephropathy,DN）是糖尿病（diabetesmellitus,DM）最常见的微血管并发症，是糖尿病患者主要的死亡原因之一。DN的基本病变是细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)在肾小球、肾小管积聚导致肾小球基底膜增厚和系膜基质增多，出现结节型与弥漫型肾小球硬化。本研究观察丹参对STZ实验性糖尿病大鼠AQP-2蛋白水平和基因水平的表达、尿白蛋白排泄率的改变，旨在探讨AQP-2的表达改变与糖尿病肾病水液代谢异常的关系以及丹参的调节效应，为DN的预防、治疗提供实验依据。　　1材料实验动物选用4周龄雄性SPF级SD大鼠［第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：S

4、CXK(军)2002-005)］60只，体质量为(165±12.5)g。SPF级饲养环境，环境温度为2O～25℃，12/12h昼夜规律，按每笼5只喂养。　　2方法　　2.1动物分组及糖尿病模型的建立随机将大鼠分为2组：正常组10只；糖尿病造模组(DM)50只；正常组进食普通饲料。糖尿病模型组进食高糖高脂饲料，即普通饲料中加入10％的猪油、10％的葡萄糖、1％的胆固醇、2％的蛋黄粉、0.2％的胆酸钠。糖尿病造模组大鼠在高糖高脂饲料喂养4周后尾静脉注射低剂量STZ(30mg／kg，Sigma公司)1次。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的糖尿病肾病改变等特点［1］。以注射后1个

5、月血糖值持续高于7.8mmol／L，尿糖、尿蛋白阳性者为模型建立成功，共选出成模动物30只，随机分到模型组，对照组和观察组3个组中，每组10只（成模率为60％）。　　2.2动物的给药及饲养灌胃剂量按大鼠用药剂量为人的10倍计算。对照组：每日灌服格列吡嗪5mg／kg；观察组：每日灌服丹参5.5g／kg。正常组和模型组灌服等体积的蒸馏水。实验期间，正常组动物自由饮水，标准饮食，模型组、治疗组、观察组动物给予高糖高脂饮食，自由饮水。　　2.3肾脏组织的留取实验第16周末时，用25%乌拉坦麻醉大鼠，打开腹腔,从腹主动脉取血,充分暴露手术视野在腹腔的两侧找到肾脏，将部分标本迅速放入4％多聚甲醛中固

6、定，用于石蜡切片。余下部分用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱中，备用于总RNA的提取。　　2.4肾脏组织学分析肾组织HE染色。镜下观察肾脏组织的一般形态结构，肾小球、肾小管、间质有无组织学异常。　　2.5免疫组织化学肾组织免疫组织化学染色(试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司)。按照免疫组化试剂盒操作步骤进行加样,以SABC法进行检测。先滴加1∶50稀释的AQP-2一抗，4℃过夜。滴加试剂2(羊抗鼠IgG)，室温放置30min。再滴加试剂3(SABC)，室温放置30min。最后DAB显色。细胞浆中呈现棕黄色颗粒为阳性反应，图像采用Miaspro图像分析系统分析。所有切片放

7、大倍数为1000×。每组取6只动物，每只动物AQP-2染色各取2张切片，观察3个视野。视场面积为480000mm2，测定阳性面积比［Aa(%)］(阳性面积／视野面积)。表1AQP－2的表达［Aa(%)］(阳性面积比)和24h尿蛋白排泄率(略)　　2.6逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)①总RNA提取:采用TaKaRa公司生产的一步法提取总RNA试剂盒，按照试剂盒说明书取200mg肾脏组织进行操作提取总RNA，用紫外分光光度法测定