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时间:2018-11-17
《丹酚酸b体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究 》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究徐秀梅,郭茂娟赵旭范英昌【摘要】 目的 观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250μg/L与10μmol/L),诱导24h后继续培养4周,观察其形态学变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-acti
2、nmRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组cTnT表达较低,SalB联合5-aza组cTnT表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组。结论SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力。【关键词】丹酚酸B;骨髓间充质干细胞;体外诱导;免疫细胞化学;实时荧光定量RT-PCR 骨髓间充质干细胞(
3、MSCs)系自体来源,取材容易,扩增能力强,是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞〔1〕。1995年,SCs体外可被5-aza诱导分化为心肌样细胞。但5-aza作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用,故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。我们前期的研究结果表明SalB可以减小心肌梗塞的面积〔3〕,并能有效地促进梗塞灶内成纤维细胞的增生,加速心脏的修复过程。那么,它对有心肌分化潜能的MSCs起什么作用呢?为进一步研究其机制,我们进行了中药单体丹酚酸B(SalB)体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究。现将研究结果报道如下。 1器材 1.1动物 (200±20)g体重的EM培养液、1∶25
4、0胰蛋白酶、EDTA、双抗,Gibco公司;胎牛血清(fetalbovineserum,FBS),Hyclone公司;D-Hanks缓冲液;percoll淋巴细胞分离液,Pharmacia公司;CD44兔多克隆抗体〔RabbitAnti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体(RabbitAnti-CD34)、即用型SABC免疫组化染色试剂盒,DAB显色试剂盒、PBS缓冲液,武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗大鼠单克隆抗体TroponinT,CardiacIsoformAb-3(CloneCT-3),美国Labvision公司;即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP8591
5、43),天津灏洋生物制品科技有限责任公司;TaqManReverseTranscriptionReagents、SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒(AppliedBiosystems)、Trizol总RNA提取试剂,天津润泰科技发展有限公司;5%CO2恒温培养箱(modelTC2323CO2incubator);倒置相差显微镜(XD-10198010);SSCs的分离培养 将大鼠脱颈处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,适量D-Hank's液冲洗骨髓,100目筛网过滤,将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁
6、缓慢滴加骨髓悬液,离心(1800r/min,20min),收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次(800r/min,5min)后接种于完全培养液(含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的L-DMEM培养液),置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养,24h后首次换液,以后每3d更换1次培养液,2周后细胞长满瓶底。 2.2MSCs的传代及纯化 待原代MSCs长满瓶底时,用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2~3min,以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞,制成单细胞悬液,按1∶3进行传代培养,直至贴壁细胞
7、彼此融合铺满瓶底时,重复上述操作,反复传至第9代。 2.3MSCs的鉴定 选用生长状况良好的第9代MSCs,用免疫细胞化学方法检测细胞表面抗原CD44和CD34。将第9代的大鼠MSCs培养于6孔板,孔板内预置无菌盖玻片,周后,细胞80%长满瓶底,用95%乙醇(加少量冰醋酸)固定15min,PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液,室温孵育20min,甩去多余液体,不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗(兔Ig
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