丹酚酸b体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究论文

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1、丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究论文徐秀梅，郭茂娟赵旭范英昌【摘要】目的观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250μg/L与10μmol/L)，诱导24h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GAT

2、A-4、Desmin和a-actinmRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT.freel,FBS）,Hyclone公司；D-Hanks缓冲液；percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔RabbitAnti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（RabbitAnti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体TroponinT,Cardia

3、cIsoformAb-3(CloneCT-3)，美国Labvision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqManReverseTranscriptionReagents、SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒(AppliedBiosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技发展有限公司；5％CO2恒温培养箱（modelTC2323CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-10198010）；SSCs的分离培养将大鼠脱颈处死，无

4、菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1800r/min,20min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次（800r/min,5min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24h后首次换液，以后每3d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。2.2MSCs的传代及纯化待原代

5、MSCs长满瓶底时，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2～3min，以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液,.freelin，PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体，不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗（兔IgG）4℃过夜。余按SABC免疫组化试剂盒操作说明进行。苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。2.4MSCs的诱导分化将第9代MSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板中，培养2d，将完全培养液换为无血清培养液，24h后进行分组诱导：SalB组(终浓度为250μg/L)、5-aza

6、组(终浓度为10μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250μg/L，10μmol/L)，并设空白对照组,仅用基本培养液(L-DMEM)诱导。诱导剂作用24h后，更换完全培养液继续培养，每3d换液1次，共4周。2.5免疫细胞化学鉴定心肌特异性蛋白cTnT取诱导后4周的细胞，用95％乙醇（加少量冰醋酸）固定15min，PBS彻底清洗。用羊血清封闭，滴加cTnT(1∶50)，阴性对照用PBS代替一抗cTnT，4℃冰箱过夜。其余步骤按超敏S-P试剂盒操作程序进行，最后苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封固。显微镜下观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为

7、阳性细胞。每组选取染色较好的8张玻片，在显微镜下每张玻片取5个视野，由数码摄像机摄入，用ImageProPlus6.0图像分析软件对结果进行分析。2.6实时荧光定量RT-PCR检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actinmRNA的表达取诱导后4周的细胞，按以下步骤进行操作：(1)RNA提取与cDNA的合成:取诱导后4周的细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，按照试剂盒说明进行反转录，反转录条件为：25℃10，48℃30，95℃5min。(2)实时PCR法检测心肌早期基因NKX2.5，GATA-4，Desmin和a-actin

8、的相对表达量：从NCBI基因库查找、验证后，确定各目的基因和管家基