丹酚酸b诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化论文

《丹酚酸b诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化论文【摘要】目的：体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），并研究中药单体丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化.方法：用贴壁培养法分离、培养、纯化MSCs，免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34.分别用含5μmol/L的5氮胞苷（5aza）和30mg/L丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs24h后，RTPCR法检测培养1，7，14和21d心肌特异性转录因子NKX2.5，GATA4和心肌特异性蛋白αactinmRNA的表达，用免疫荧光法检测诱导后αactin的表达情况.结果：获得

2、纯化的MSCs.freelRNA在MSCs有基础性的表达，而分别以5aza和丹酚酸B处理24h后，NKX2.5和GATA4mRNA表达增强，7d时表达达高峰，以后维持在高水平，与空白对照组相比，有统计学差异(P0.01).未诱导的MSCsαactinmRNA表达呈阴性，丹酚酸B诱导后的第14日，出现αactinmRNA的表达.结论：用贴壁培养法可获得纯化的MSCs，丹酚酸B可诱导MSCs向心肌样细胞分化.【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养丹酚酸B心肌细胞0引言当前，细胞移植作为一项极具开创性意义的治疗方法及技术用于改善心功能及心肌活力已受到广

3、泛关注.骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)存在于骨髓基质中，由于MSCs取材方便、操作简单、增殖能力强，且具有干细胞的多向分化潜能，可被诱导成为间充质来源的多种成体细胞［1-3］等特点，被称为是组织工程最具应用前景的一种干细胞，将MSCs诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织，具有一定的临床意义.MSCs向心肌细胞定向分化需要一定的诱发因素.体外研究大多学者都使用5氮胞苷（5Azacytidine，5aza）作为诱导剂对MSCs进行诱导分化为心肌细胞.然而作为一种白血病化疗药物，5aza会残留在细胞DNA中

4、［4］，因此诱导后的移植细胞潜在的生物安全性令人担忧.而中药具有临床应用安全和长期有效的特点，许多中药制剂、单味中药及中药单体都具有诱导细胞分化成分.丹酚酸B是丹参水溶性成分中最主要的活性成分，具有和一些诱导剂（如β巯基乙醇、DMSO）相似的抗氧化作用，因此开展丹酚酸B诱导MSCs分化有一定的开创性.1材料和方法1.1材料实验动物：SD大鼠，雄性，体质量90~100g，由广州中医药大学实验动物中心提供.主要试剂：DMEM培养基（GBICO/BRL）,胎牛血清（奥地利PAA）,丹酚酸B（广州市药检所，标准品）,5aza(Sigma),兔抗大鼠CD4

5、4多抗（博士德）,兔抗大鼠CD34多抗（博士德），CY3标记的羊抗兔IgG（博士德）,Hoechst33342(Sigma),AllPrepRNA/ProteinKit（Qiagen）,OneStepRTPCRKit（Qiagen）.1.2方法1.2.1MSCs分离、培养无菌条件下取大鼠股骨，以含150mL/L胎牛血清的DMEM培养液冲洗髓腔，以5×109个/L接种.当细胞接近80%铺满瓶底后，以2.0×108个/L细胞的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养.取第3代的MSCs进行实验.1.2.2MSCs鉴定1.2.2.1形态学鉴定相差显微镜下观察细

6、胞形态，拍照.1.2.2.2免疫荧光鉴定MSCs种于盖玻片上，步骤如下：多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3次，每次3min.加入含5mL/LTritonX100和50mL/LBSA的PBS，30min后用PBS洗3次，每次3min.加一抗兔抗大鼠CD44（1∶100）,兔抗大鼠CD34（1∶100）多克隆抗体，各100μL，放入湿盒内4℃过夜.用PBS冲洗3次，每次5min.加入荧光二抗Cy3IgG（1∶100），室温下避光孵育30min后，用PBS冲洗3次，每次5min.加10mg/L的Hoechst33342溶液，放入湿盒内37℃避光孵育

7、10min.PBS清洗3次，每次3min.在激光共聚焦显微镜下观察并拍照.对照片滴加PBS代替一抗，其余相同.1.2.3丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化将对数生长期的P3MSCs以2.0×108个/L接种于6孔板内，每孔1mL.待细胞生长至亚融合状态（约第3日），将细胞分为3组，每组8个孔.A组细胞用MSCs完全培养基、B组细胞用终浓度为5μmoL/L的5aza培养基、C组细胞用含丹酚酸B30mg/L的培养基共同培育24h后，吸弃培养基，用PBS清洗3次，加入MSCs完全培养基继续培养.分别在诱导1，7，14和21d后收集细胞，提取细胞总RNA

8、，检测浓度后进行RTPCR检测NKX2.5,GATA4,αactinmRNA的表达.提取总RNA作为模