灯盏花提取成分对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响论文

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1、灯盏花提取成分对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响论文.freelHerbaErigerontisculturedinvitrobyhighpressure［Abstract］ObjectiveToobservetheapoptosisandlookforapoptoticgeneofRGCsculturedinvitrobyhighpressurebyaddingtheconstituentefromHerbaErigerontis（DSX）.Methods).Putthepressure80mmH

2、gtoRGCsinclosetightlyculturebottleforfourhours，thencollectRGCsandlookfortheapoptoticgenebygenechip.ResultsTheapoptosisofmodelgroupandcontrolgrouphigherthanDSXgroupculturedinthepressureof80mmHg.TosteffectiveconstituentinprotectingRGCsinvitro.Theexpressingupr

3、egulationofS100BandNGFRisthedirectreasonsoftheapoptosisofRGCsbypressure.［Keya公司）、trizol（Invitrogen公司）、EDTANa2（国药集团化学试剂有限公司）NucleoSpinRNAcleanup试剂盒（MACHEREYNAGEL，Germany）等。DSX由中药灯盏花提取。1.3主要仪器HBO50型倒置相差显微镜（德国ZEISS公司）、超净工作台（苏州医疗器械厂）、MCO-150A型二氧化碳培养箱（日本三洋公司）、

4、大鼠Oligo芯片、LuxScan10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）等。1.4培养器皿的制备25cm2培养瓶和直径35mm培养皿（内置盖玻片），以0.1mg/ml多聚鸟氨酸（polyLornithine，硼酸缓冲液稀释）室温包被2h后，再以4μg/ml层粘连蛋白(laminin，PBS液稀释)包被，37℃过夜备用。以羊抗鼠IgG（1∶100，PBS液稀释）室温包被培养皿24h，继以小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体（1∶150，PBS液稀释）室温包被24h。1.5RGCs的培养出生1~3天S

5、D乳鼠20只断头处死，无菌条件下取眼球，体视显微镜下钝性分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化20min，用220目网眼无菌钢网滤过，小牛血清终止消化，1000r/min离心5min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液后加入经羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体包被的培养皿，37℃条件下孵育30min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合，去上清，用无血清培养液反复漂洗，清除培养皿表面未黏附的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化10min，小牛血清终

6、止消化，1000r/min离心5min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液。计数后按每瓶5×105个细胞加入经多聚鸟氨酸和粘连蛋白包被的培养瓶和培养皿。1.6视网膜神经节细胞体外培养按以上方法制备的纯化RGCs，培养24h后，取出培养皿内置的盖玻片，固定，用Pischinger法进行鉴定。按以上方法制备的纯化RGCs18瓶，培养24h后随机分为3组，实验组加入DSX（终浓度0.1mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用

7、打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80mmHg，加压时间4h，空白对照组不加压，37℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。按以上方法制备的纯化RGCs30瓶，培养24h后随机分为3组，每组10瓶，实验组加入DSX（终浓度0.1mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80mmHg，加压时间4h，空白对照组

8、不加压，37℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用基因芯片进行凋亡基因的检测。1.7统计学方法采用SPSS14.0版统计软件包进行统计，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验，差异基因的表达用t检验。2结果2.1视网膜神经节细胞的鉴定结果Nissel小体染色检查：免疫组化染色结果显示细胞胞浆内有蓝色颗粒，证实细胞类型为神经元细胞。因此，依据细胞的组织来