特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞hepg2分化的作用及机制

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1、授予单位代码10089学号或申请号20152305中国图书分类号R34HebeiMedicalUniversity硕士学位论文学术学位特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化的作用及机制研究生：肖志刚导师：齐锦生教授专业：生物化学与分子生物学二级学院：基础医学院2018年3月目录中文摘要……………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………6研究论文特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化的作用及机制前言……………………………………………………………………14材料与方法…………

2、…………………………………………………15结果……………………………………………………………………30附图……………………………………………………………………33讨论……………………………………………………………………39结论……………………………………………………………………43参考文献………………………………………………………………43综述胚胎发育与肿瘤发生相关信号通路…………………………48致谢…………………………………………………………………………61个人简历……………………………………………………………………62中文摘要特定发育阶段胚肝细

3、胞诱导肝癌细胞HepG2分化的作用及机制摘要目的：肿瘤死亡率已跃居人类疾病死亡原因的第二位。中国年均约55万人死于肝癌，是世界平均死亡率的2.21倍。肝癌中最重要类型是肝细胞性肝癌（Hepatocellularcarcinogenesis，HCC），约占原发性肝癌的90%。但目前缺乏针对HCC的特效治疗方案，传统手术、放、化治疗复发率高、毒副作用大，病人生存质量极差。因此应重新认识肿瘤发生和久治不愈的原因，寻找有效治愈肿瘤的新思路新方法。研究证实，胚胎干细胞与肿瘤细胞具有很多共有特征：可塑性、免疫逃逸、永生化，均表达胚胎特征性蛋白。近年来，一系列基

4、础和临床的研究显示，肿瘤细胞起源于增值和分化异常的组织来源干细胞。大量研究发现，胚胎干细胞微环境可抑制肿瘤的侵袭行为，并逆转其恶性表型。据此导师齐锦生教授认为，肿瘤细胞为停滞于某分化阶段，而呈无限增殖的“正常干细胞”或细胞的“返祖”现象。并进一步提出，用特定发育阶段的胚胎细胞可诱导相同组织来源的肿瘤细胞分化（同源同步诱导分化），从而达到治疗肿瘤的目的。前期实验选用不同发育阶段的胚肝细胞与肝癌细胞HepG2共培养，已初步证实胚肝细胞可通过重建肝细胞核因子HNF-4α调控环路，诱导肝癌细胞HepG2分化。前期研究表明，胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化

5、无种属差异性，并以非接触式的通讯方式起作用。因此，引起诱导分化作用的信号通路应当是高度保守、外分泌性的。Wnt/β-catenin信号通路是一个跨物种的高度保守的信号通路，与发育、分化、增殖等密切相关。Wnt信号作为关键调节分子，以自分泌/旁分泌形式来发挥作用。在肝脏的发育过程和功能维持以及体外诱导干细胞向肝细胞的分化过程中，Wnt/β-catenin信号通路起着关键作用。那么，胎肝细胞是否通过调整Wnt/β-catenin通路，激活HNF-4α基因表达，从而诱导HCC细胞分化呢？无相关文献报道。本研究旨在重新认识肿瘤发生本质基础上，以肝癌为研究对

6、象，分离纯化鉴定胚肝细胞，证实特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化作用，验证“同源同步诱导分化”理论，并进一步探究诱导分化过程中的相1中文摘要关信号通路及分子机制，为治疗HCC提供实验依据为，肿瘤治疗提供新的思路和方法。方法：1.特定发育阶段小鼠胚肝细胞的分离纯化及鉴定在课题组前期实验研究的基础上，选用发育13.5d（E13.5d)胎鼠进行实验。采用Ⅳ胶原酶消化法，消化小鼠胚肝组织，分离为单个胚肝细胞；多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞，纯化胚肝细胞。HE染色法观察胎肝组织形态，免疫组化法检测胎肝特定发育阶段蛋白AFP、CK19表达情况，流

7、式细胞术检测胎肝细胞中干细胞标记物CD90.1和CD133阳性表达率，免疫荧光法检测胚肝细胞AFP表达情况。2.细胞培养胚肝细胞用高糖DMEM培养；HepG2细胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培养基培养，0.25%的胰蛋白酶消化传代，接种于100mL培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。3.模型建立及分组利用六孔板的“Transwell”小室建立HepG2细胞与胚肝细胞的非接触式共培养体系。HepG2细胞与发育13.5d的胚肝细胞共培养，HepG2细胞培养于在Transwell孔的下部，胚肝细胞培养于在Transwell

8、的膜上部。探究E13.5d的胚肝细胞诱导HepG2细胞分化作用，分为四组：untreated组(HepG2细胞单独培养)；