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1、腹透液相关浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞周期蛋白的影【摘要】目的研究腹透液相关浓度葡萄糖（1.5％、2.5％）对人腹膜间皮细胞周期和周期蛋白p21的影响及葛根素的拮抗作用。方法人腹膜间皮细胞在含糖（1.5％、2.5％）、含糖含葛根素(葛根素终浓度为100mg/L)的无血清培养基中培养24h后,用流式细胞仪分析细胞周期,C)andprotectionofpuerarin.MethodsHPMCsfreeRPMI1640mediumcontainingglucoseofdifferentconcentrations(1.5%and2.5%)andpuerarin(100mg/
2、L)for24hours.Thecellcycledistributionetry.Theexpressionofp21ostofthecellsbecamehypertrophic,andulatedexpressionofp21,berofthecellsarrestedinG1andp21expressionsdecreasedingroupsofpuerarin.ConclusionHighglucosestimulatedtheexpressionofp21,ightberelatedtothehypertrophyandarrestintheG1phase
3、ofmesothelialcellsbyhighglucose.Puerarinmightantagonizetheeffectofhighglucoseofthecyclesofmesothelialcellsandtheircyclin.Keyesothelialcells;glucose;cyclin;puerarin腹膜纤维化所致的腹膜功能衰竭是腹膜透析应用受限的主要原因。研究发现高糖可使间皮细胞肥大,间皮细胞层受损或缺失,导致腹膜纤维化和功能丧失［1］,有效保护腹膜间皮细胞能延缓腹膜纤维化。细胞周期调控蛋白p21过度表达与细胞肥大有关［2-3］。葛根素能拮抗
4、腹膜透析液对腹膜间皮细胞的损伤,发挥抗纤维化作用［4］。本实验观察高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞周期和p21蛋白的影响及葛根素的拮抗作用,从细胞周期和周期蛋白角度探讨葛根素抗腹膜纤维化的分子机制。1材料和方法1.1材料含糖腹膜透析液购于广州百特公司,葛根素为浙江康恩贝制药股份公司产品,血清、RPMI1640粉剂、胰酶购自GBCO公司,抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体、抗p21抗体购自北京中山生物技术有限公司,流式细胞仪为BectonDickinson公司产品。1.2方法1.2.1人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定取非尿毒症和糖尿病择期
5、手术患者的网膜作为细胞,按文献［5］法培养间皮细胞。当细胞生长融合时用胰酶消化,按1∶3传代,第3代用于实验。经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性,抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定。1.2.2间皮细胞分组及在不同条件下的形态观察将融合后的腹膜间皮细胞消化后接种于6孔培养板中,培养至亚融合后加入无血清RPMI1640培养基,同步化培养24h后分别加入含不同浓度葡萄糖（1.5%、2.5%）和（或）葛根素(葛根素终浓度为100mg/L)的培养基中培养24h，在倒置显微镜下观察细胞形态。实验分对照组（不含糖不含葛根素）、含糖1.5
6、％组、含糖2.5％组及葛根素组、含葛根素含糖1.5％组、含葛根素含糖2.5％组6组。1.2.3流式细胞仪分析各组间皮细胞的周期分布腹膜间皮细胞在不同条件培养基中培养24h后用PBS液洗2次，胰酶消化，70%乙醇固定后，重悬于PBS液中。加入RNA酶50mg/L,避光30min离心去上清液。碘化吡啶于暗处染色30min后，用流式细胞仪检测，得到细胞周期各时相百分比。1.2.4in后进行10%、15%的SDS-PAGE电泳，采用电转印法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，膜在室温封闭4h，加1∶100抗p21抗体，4℃过夜，后加二抗室温作用1h，洗膜后显色。1.3统计学处理
7、数据采用±s表示，用SPSS12．0统计软件对所得数据进行分析，各组腹膜间皮细胞p21表达的比较采用单因素方差分析，P<0.05表示存在显著性差异。2结果2.1各组人腹膜间皮细胞周期的比较对照组培养24h的间皮细胞中G1期细胞比例为（62.5±3.3）%,而含糖1.5％组和含糖2.5％组G1期细胞比例增高,分别为（72.1±3.54）%和（72.5±3.4）%，与对照组有显著性差异(P<0.05)，含糖2.5％组和含糖1.5％组无显著性差异（P＞0.05）。含葛根素含糖1.5％组和含葛根素含糖2.5％组G1期细胞比例分别为（64.7±4.
