rbx诱骨活性成分的分离与纯化

《rbx诱骨活性成分的分离与纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、RBX诱骨活性成分的分离与纯化　　摘要:目的重组合异种骨（RBX）作为一种新型植骨材料在临床治疗骨缺损、骨不连等病例中取得了显著疗效.需进一步研究重组合异种骨中诱骨活性蛋白的相对分子质量范围.方法采用肝素亲和层析技术纯化RBX中诱骨活性蛋白即骨形态发生蛋白（BMP），利用小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性，再用聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）测量RBX中诱骨活性蛋白纯化后的相对分子质量.结果在纯化近20倍后，获得8.23mg高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日，有大量软骨细胞及软骨岛的出现，在局部区域还可见到条索状骨小梁出现，SDS-PAGE电泳发现

2、这种蛋白质的相对分子质量为35×103，经还原后单体的相对分子质量为22×103.结论重组合异种骨（RBX）中35×103的蛋白质经还原后为22×103，其单独使用具有异位成骨活性，为RBX的临床应用提供了理论依据.　　Keyp;purification　　Abstract:AIMAsaneaterial，re-constitutedbonexenografthavegainedmuchsuccessintherepairofbonedefectandbonenonunion.Tostudyrelativemolecularmassofosteoinductionpr

3、oteininreconstitutedbonexenograft.METHODSUsingheparinsepharoseCl-6Bchromatography，theosteoinductionproteininreconstitutedbonexenograft（bonemorphogeicprotein，BMP）purificationplantationintothethighmusclesofmouse.Usingsodiumdodecylsulfate-polyacry-lamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE），themole

4、cularmassofpurifiedproteincouldbeknog，andinvivobytheendof10thday，muchmorechondrocytesandcartilagematrixformandtrabeculaecanal-sobeenseen.FromSDS-PAGE，highlypurifiedproteinishomodinerproteinolecularmassof35×103，and22×103onreduction.CONCLUSIONThe35×103proteininreconstitutedbonexenograftol

5、・L-1脲/0.5mol・L-1GaCl/1mmol・L-1NEMI）24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制BMP，将其复溶于纯化液（4mol・L-1盐酸胍/0.5mol・L-1GaCl/1mmol・L-1NEMI），上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP.在0.08MPa负压下将其与牛松质骨载体（本校西京医院自制）按1∶5质量比复合，蒸馏水透析72h，冻干.　　1.2肝素亲和层析纯化　　取160mg部分纯化的蛋白复溶于10mL的平衡缓冲液中（BufferA:6molӥ

6、9;L-1脲/50mmol・L-1Tris.HCl/0.1mol・L-1NaClpH7.0），以20000g的速度离心30min，除去其中不溶的物质.用上清对160mm×10mm的肝素亲和层析柱加样（注意不要破坏凝胶表面）.层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱，即含有0.1，0.15，0.5mol・L-1NaCl的BufferA溶液，分别收集洗脱下来的蛋白质，经透析、离心、冻干后保存，测质量.　　1.3生物活性检测　　选用雄性BALB/c小鼠（第四军医大学实验动物中心供给）10只，体质量（20±2）g，随机分成2组，每组5只.

7、将冻干后的蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中，其中A组植入0.4mg纯化后的蛋白质，B组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第10日全部处死，取出植入物周围2cm的软组织.标本均经组织学常规处理，切片行HE染色，镜下观察异位成骨的情况.　　1.4蛋白相对分子质量的测定　　采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，它多用于蛋白质及核酸的Mr测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇（DTT）或不含有DTT的样品缓冲液中，90℃加热3～5min，离心后用上清加样.电泳凝胶为50mL・L-1的积层胶、125mL・L-1的分离胶.电泳完毕