rbx诱骨活性成分的分离与纯化论文

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1、RBX诱骨活性成分的分离与纯化论文.freelg高度纯化的蛋白质，组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日.freelaterial，re-constitutedbonexenografthavegainedmuchsuccessintherepairofbonedefectandbonenonunion.Tostudyrelativemolecularmassofosteoinductionproteininreconstitutedbonexenograft.METHODSUsingheparinsep

2、haroseCl-6Bchromatography，theosteoinductionproteininreconstitutedbonexenograft（bonemorphogeicprotein，BMP）purificationplantationintothethighmusclesofmouse.Usingsodiumdodecylsulfate-polyacry-lamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE），themolecularmassofpurifiedprotei

3、ncouldbeknog，andinvivobytheendof10thday，muchmorechondrocytesandcartilagematrixformandtrabeculaecanal-sobeenseen.FromSDS-PAGE，highlypurifiedproteinishomodinerproteinolecularmassof35×103，and22×103onreduction.CONCLUSIONThe35×103proteininreconstitutedbonexenog

4、raftolL-1脲/0.5molL-1GaCl/1mmolL-1NEMI）24h，提取上清，经透析、离心后得到粗制BMP，将其复溶于纯化液（4molL-1盐酸胍/0.5molL-1GaCl/1mmolL-1NEMI），上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP.在0.08MPa负压下将其与牛松质骨载体（本校西京医院自制）按1∶5质量比复合，蒸馏水透析72h，冻干.1.2肝素亲和层析纯化取160mg部分纯化的蛋白复溶于10mL的平衡缓冲液中（BufferA:6molL-1脲/50mmolL-1Tris.HC

5、l/0.1molL-1NaClpH7.0），以20000g的速度离心30min，除去其中不溶的物质.用上清对160mm×10mm的肝素亲和层析柱加样（注意不要破坏凝胶表面）.层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱，即含有0.1，0.15，0.5molL-1NaCl的BufferA溶液，分别收集洗脱下来的蛋白质，经透析、离心、冻干后保存，测质量.1.3生物活性检测选用雄性BALB/c小鼠（第四军医大学实验动物中心供给）10只，体质量（20±2）g，随机分成2组，每组5只.将冻干后的蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中

6、，其中A组植入0.4mg纯化后的蛋白质，B组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第10日全部处死，取出植入物周围2cm的软组织.标本均经组织学常规处理，切片行HE染色，镜下观察异位成骨的情况.1.4蛋白相对分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，它多用于蛋白质及核酸的Mr测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇（DTT）或不含有DTT的样品缓冲液中，90℃加热3～5min，离心后用上清加样.电泳凝胶为50mLL-1的积层胶、125mLL-1的分离胶.电泳完毕后，用考马斯亮蓝R-250染色，再测

7、其相对分子质量.2结果将部分纯化的蛋白质加入层析柱后，洗脱液以120cmh-1的速度洗脱（Fig1所示）.用BufferA洗脱时，未吸附的蛋白质基本都流出;改用BufferB液（含有0.15molL-1NaCl），洗脱吸附较弱的蛋白，从Fig1可见此时pH值下降，离子浓度增加，且有较大量的杂蛋白流出，称为B峰;用含有0.5molL-1NaCl的BufferC液洗脱时，获得C峰，此峰为我们主要收集的目的蛋白.A段蛋白与肝素亲和层析无亲和力，故弃去不用，将B峰、C峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约24h，其间换液3

8、次.透析发现，C峰蛋白有白色絮状沉积，表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶于水.将C份蛋白真空冻干后，测其质量为8.23mg，纯化近20倍.手术后的动物均未出现感染，生长良好.小白鼠于术后第10日处死，切片经HE染色后观察发现，A组所有标本切片上均可见到明显的软骨岛形成，软骨细胞大而圆，非常明显，在个别区域可看到条索状骨小梁的出现（Fig2），周围有少量淋巴细胞浸润;B组无任何变化.重组合异种骨自198