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1、实验四、植物活性多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化【实验目的】1、了解多糖提取和纯化的一般方法。2、学习多糖的定量测定方法。【实验原理】多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以a-或0-糖苷键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性［1］,大量药理及临床研宄表明，多
2、糖类化合物是一种免疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点［2］。本实验采用常规法（即水溶醇沉法）从植物组织中提取出水溶性粗多糖，对提取得到的多糖进行分离纯化，除去色素及小分子杂质，并采用Sevage法除蛋白。用蒽酮比色法测定多糖的含量。多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙院法、三氯醋酸法，这些方法的原理是
3、使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4:1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。本实验采用Sevag法（氯仿：正丁醇=4:1混合摇匀）进行脱蛋白，用DEAE-纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490rnn处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。【实验试剂和器材】1.
4、试剂活性炭、硫酸，5%苯酚溶液，葡萄糖，过氧化氢，乙酸铅，丙酮，乙醇、无水乙Na2HP04•12H20NaH2P04•2H20乙醚平衡缓冲溶液：0.01mol/LTris-HCL，PH=7.2。洗脱液：A:O.lmolNaCl，0.01molTris-HClPH=7.2;B:0.5molNaCl，0.01molTris-HClPH=7.2OSevag试剂：氯仿:1.材料香蕉皮粉末市售香蕉的皮。2.器材离心机，林斤袋、分光多功能粉碎机、恒温水浴锅、DEAE-纤维素，光度计、层析柱(2.5X30cm)【操作方法】一、粗多糖的提取将香蕉皮切碎烘干后，粉碎过
5、筛。称取2g,采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1:10,浸提温度为80°C,浸提时间1.5h，共提取4次，合并4次浸提液。浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即以1°%的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇搅拌，置冰箱24h，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。二、粗多糖的纯化粗多糖溶液置于分液漏斗中，按照提取液体积的1/5量加入Sevag试剂（氯仿：正丁醇=3:1混合摇匀），振荡20mi
6、n，3000r/min的转速下，离心15min，得上清液测其体积，继续加相应体积的Sevag试剂，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无乳白色变性蛋白质析出为止。收集上清液，加足量活性炭，摇匀，恒温30min,过滤，得滤液备用。将上述滤液倒入下端扎好的截流分子量为6000〜8000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸馏水透析48h,期间每2h更换一次水，经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。加3倍体积95%乙醇醇沉。沉淀放入
7、冰箱干燥，获得白色固体粉末，即得精制香蕉皮多糖。三、多糖的测定（苯酚•硫酸法）1.样品溶液的制备精密称取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至50ml,即为待测样液2.标准曲线的制备精密称取105°C干燥至恒重的葡萄糖标准品1g,置于100ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备液1ml定容至100ml，配成0.1mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖标准液0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6ml于25ml具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0ml,再各加5%苯酚溶液1.0ml摇匀，迅速加入浓H2
8、SO4溶液5ml,振摇5min,放置10min,置沸水浴中加热20min,取出冷却至室温，于490nm,以试
