靶向tlr2联合促渗剂提升基因透皮效率作用及体制研究

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1、靶向TLR2联合促渗剂提升基因透皮效率作用及体制研究第一章促渗剂二甲基亚砜在小鼠透皮实验中的最适浓度研究前言皮瓣移植是整形美容和创伤外科修复各种原因造成的皮肤软组织缺损的重要方法，但存在着皮瓣缺血及缺血再灌注损伤等合并症，有导致皮瓣坏死的可能。缺血使皮瓣血液循环障碍集中表现为血管持续扩张和微血栓形成，而缺血再灌注损伤则使白细胞与内皮细胞的粘附程度增加并产生大量氧自由基及炎症介质，进一步加重缺血引起的损伤，最终导致皮瓣不可逆转坏死。传统的口服、静脉注射、皮瓣内注射等用药(血管扩张剂、肝素等抗凝血药物、肾上腺糖皮质激素等药物以及血管内皮生长因子基因等等)方式有一定治疗作用，但也存在一定弊端

2、（全身性副作用、皮瓣损伤、给药不方便、药效低下等)。透皮给药系统(transdermaldeliverysystem，TDS)可以增加药物（或者治疗基因）在皮瓣局部的浓度，而最终被全身吸收并产生副反应却很微弱，从而提高疗效并降低副作用，为治疗缺血性皮瓣提供新的研究方向。透皮吸收制剂既可以提高皮瓣成活率，又能减轻患者创伤和痛苦，成为一种新型的促进皮瓣成活的技术手段。我们试图研究将血管扩张剂、抗凝剂等药物或相关基因通过透皮吸收的途径进入皮瓣发挥药理作用，促进皮瓣成活。二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO)是一种有机硫化合物，化学式(CH3)2S0，无色，无味，易潮湿，可

3、溶于有机溶剂和水溶液，研究发现其可增强物质通透性，有助于活性分子透过生物膜⑴，可促进抗病毒、抗生素等药物的渗透吸收作用。然而DMSO促基因经皮瓣渗透吸收的适宜浓度鲜有研究报道，本实验选择浓度分别为30%，10%,5%和0%的DMSO作为促渗透剂，选取Balb/c小鼠背部皮肤模拟皮瓣，在皮瓣表面施用不同浓度包含有报告基因pORF-LacZ质粒的DMSO制剂进行处理，在其下方收集统计透过的质粒量。..材料与方法1%RNA琼脂糖凝胶配制：称取1.5g琼脂糖粉放入锥形瓶内,加1XTAE缓冲液150ml,混匀，置微波炉中高火加热直至颜色透明。待冷却至6(rC左右（不资手）加溴化乙徒(EB)，混勾

4、。将溶液倒入制胶板上，插入小头梳子，待胶凝固后，小心取出梳子，即为凝胶。PBS缓冲液：PBS配方：氯化钠4g，氯化钟O.lg磷酸氢二钠7.1g，憐酸二氧钠0.27g，定容500ml。检测DMSO的浓度是否影响基因转染效率和促进经皮渗透效率的最适浓度，不同配方的准备主要以在总体积为150ul中的DMSO所占的百分比为基础。每个配方中都含有150ug的pORF-LacZ质粒。DMSO在每个配方中的浓度分别为30%(fonnula1),10%(formula2),5%(fonnula3),0%(formula4)。第二章RA和LP对小鼠皮肤claudiii-4和ZO-1影响的实验研究前言表皮

5、紧密连接（tightjunction，TJ)是阻止物质在表皮不同细胞层的细胞旁传递的屏障，也是一种可以随内外环境变化而发生松紧改变的组织结构。TJs主要由闭锁蛋白（occludin)、闭合蛋白（claudins)家族等组成，对细胞旁屏障的存在起着重要作用，而任何TJ成分表达发生改变都会影响其完整性。daudin-4主要分布在颗粒层的第2-3层，属于完整TJs的一部分。Z0-1(zonulaoccludens-1)是一种周围膜蛋白，是首先被发现的TJs分子，聚集于TJ周围，在小鼠表皮，Z0-1几乎分布在所有的角质形成细胞层。人角质形成细胞能在角质层下方表达TLR2，研究发现活化TLR2能

6、增强皮肤屏障，其机制可能是经过信号传导改变TJ蛋白表达，而阻断TLR2信号能抑制TJ蛋白上调。研究表明[1、2]，活化或者干扰体外培养的角质形成细胞中的TLR2可以改变皮肤紧致度，并改变其通透性。当敲除TLR2,其紧致度大大降低。然而，体内是否存在同样的生物调节，抑制表皮角质形成细胞TLR2的表达是否能下调TJ蛋白表达，从而提高皮肤对治疗药物或者基因的透过性，尚有待研究阐明。我们尝试应用TLR2抑制剂脂质羊毛硫氨酸肽(lipolanthioninepeptides，LP)联合维甲酸(Retinoids,RA)或者单独进行干预，探讨抑制TLR2表达是否能下调TJ蛋白中的claudin-4

7、和Z0-1表达，进而提高治疗药物或者基因透过局部皮肤发挥相应作用的效率。..材料与方法一.实验材料1.主要实验试剂无水乙醇（C2H50N)广州化学试剂厂盐酸（HCl)中国医药集团上海化学试剂公司氯化钠（NaCl)国药集团化学试剂有限公司二甲笨（CgHio)广州化学试剂厂石蜡上海标本模型厂多聚赖氨酸上海博光生物科技有限公司苏木精（Ci6HMCV3H20)广州捷倍思公司伊红(C2oH8Br405)广州捷倍思公司磷酸二氢钠(NaH2P02H20)国药