tag1信号对胶质瘤干细胞增殖与分化作用及相关基因调节机制研究

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1、TAG1信号对胶质瘤干细胞增殖与分化作用及相关基因调节机制研究第一章人胶质瘤细胞株中胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定一、引言胶质瘤是最常见的颉内实体瘤，是一类增殖迅速、侵袭度高、致死率高的恶性肿瘤。虽然随着临床手术治疗、放疗、化疗等综合治疗技术的综合运用，目前胶质瘤的临床疗效与预后仍然没有明显改善越来越多的研究证据显示，胶质瘤中包含有一群与普通胶质瘤细胞具有不同特征的干细胞，称为胶质瘤干细胞。尽管这一亚群在胶质瘤中所占比例不一，但其具有自我更新、无限增殖和多向分化的能力，这可能在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起到非常关键的作用。已不断有研究从原代培养的胶质瘤细胞及

2、稳定的恶性胶质瘤细胞系中发现胶质瘤干细胞[⑷,分离鉴定并进一步了解它们的生物学特性及其相关机制，具有非常重要的意义。人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87作为稳定的胶质瘤细胞系被广泛的用于各种胶质瘤及胶质瘤干细胞的相关研究中已有的研究均认为，人U87细胞系中存在有胶质瘤干细胞。然而由于胶质瘤干细胞亚群在胶质瘤细胞中的含量较少，选择合适的方法分离培养并大量扩增其中的胶质瘤干细胞成为制约胶质瘤干细胞研究的瓶颈。目前对于胶质瘤干细胞的分离培养主要釆用以下两种方式：第一种是通过流式细胞术或免疫磁珠技术对CD133阳性或ABCG2阳性等细胞进行分选，从而富集胶质瘤干细胞；但这种

3、方式操作较复杂，需要一定的设备，研究成本高，对细胞的活力也有较大的影响，而且由于目前对特异性胶质瘤干细胞的表面标志物还知之甚少，故使用上述标记物进行分选存在敏感性和特异性的疑问。.二、材料和方法0.0lmol/L磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)的配制：称取8.50gNaCl,0.20gKCl,2.C搅拌溶解完全后定容至lOOOtnL,滤纸过滤，调节PH值为7.0，室温或4°C保存备用。细胞冻存液：在需要使用的时候配制，按DMEM/F12培养液:FBS:DMSO=5:4:1配制。4%台盼蓝：取台盼蓝4g,加双蒸水研磨后

4、，加双蒸水至lOOmL,1500rpm,ISmin离心，吸取上层液，即为4%的溶液，4°C保存，用时用0.Olmol/LPBS稀释10倍。.第二章TAG1/APP信号通路在胶质瘤干细胞增殖、分化中的表达一、前言根据脑肿瘤干细胞理论，在胶质瘤组织中的大部分细胞因不具有或仅具有限的增殖潜能，不是胶质瘤的成瘤细胞；而有一小部分细胞因具有自我更新、无限增殖和分化成瘤能力，是胶质瘤的成瘤细胞；这个细胞亚群被称为胶质瘤干细胞，是胶质瘤发生、发展及复发的根本动力。鉴于胶质瘤干细胞对胶质瘤致瘤性的重要作用，对胶质瘤干细胞生物学行为及分子调控机制的研究已成为目前胶质瘤研究

5、的重要方向之一[45]。随着分子生物学研究的进展，人们发现脑胶质瘤的发生与发展可能与一些相关基因、受体、信号分子及信号转导通路密切相关；细胞外微环境中的信号分子可能导致脑肿瘤干细胞增殖、分化等生物学行为的变化。但是，国内外研究对于脑肿瘤干细胞的确切的信号通路的存在、作用及功能还是不甚了解，因此，发现新的脑肿瘤干细胞信号通路并进行针对性的研究已成为目前脑肿瘤干细胞研究的热点。AP前体蛋白APPXAmyloid0precursorprotein,APP)在脑内广泛分布，其生理功能至今仍不很明了，生理水平的APP涉及膜信号传导、细胞粘附、神经细胞的迁移、分化与再生、突

6、触发育、神经保护等主要功能。近年来研究表明，胶质增生组织及胶质瘤细胞中APP表达明显增高，认为可能和细胞信号异常有关，但其主要的机制不清。研究发现，转运至细胞膜表面的成熟的APP具有介导细胞信号的作用。APP的氨基端具有保守的生长因子样区域，具有膜受体蛋白功能，可结合配体蛋白，借助APP特异性分泌酶的剪切，产生其胞内剪切片段AICD(APPintracellulardomain,AICD),进入细胞核内调节细胞的生理过程。..二、材料和方法脑胶质瘤干细胞增殖方法详见第一部分，采集第5代以后的U87胶质瘤干细胞，分离成单细胞后使用无血清培养基（DMEM/F12)+

7、因子（B270.2%、bFGF20ng/tnl、EGF20ng/ral)重悬，放置在常规氧浓度37°C，5%C02培养箱中培养3天；按照下述方法，提取细胞总RNA进行TAG1/APP信号的RT-PCR检测，提取细胞的总蛋白进行TAG1/APP信号的EM/F12培养基重悬，放置在常规氧浓度37°C，5%C03培养箱中诱导分化0、1、5天；收集细胞后按照下述方法，提取细胞总RNA进行TAG1-APP信号的qRT-PCR检测，提取细胞的总蛋白进行TAG1/APP信号的g/ml。将标准品按0，1，2,4，8,12，16，20ul加入到1.5ml的Ep管中

8、，加PBS补足到20ul