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时间:2018-10-25
《川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞hif—1α、vegf表达及细胞增殖的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF—1α、VEGF表达及细胞增殖的影响[]目的研究川芎嗪对缺氧时体外培养的牛眼视X膜血管内皮细胞(BREC)VEGF表达及细胞增殖活性的影响,探讨川芎嗪治疗视X膜新生血管性疾病的药理机制及可行性。方法CoCl2模拟缺氧处理培养的BREC细胞,用浓度分别为20、40、120μg/mL的川芎嗪分别加入细胞培养液中24h,采用ELISA法检测细胞培养上清液VEGF含量,免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞PA的表达、细胞内ATP含量以分析细胞增殖能力,采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达。结果川芎嗪可减少缺氧引起
2、的视X膜血管内皮细胞中PA的表达,降低细胞内ATP含量,降低培养上清液中的VEGF浓度,且呈剂量依赖性。结论川芎嗪可抑制缺氧引起的视X膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。 [关键词]川芎嗪;视X膜新生血管;血管内皮生长因子;缺氧诱导因子 []R-33[]A[]1674-4721(2012)11(b)-0005-02 笔者在缺氧时的牛眼视X膜血管内皮细胞(BREC)培养上清液中加入不同浓度的川芎嗪,研究其对HIF-1α表达的影响,及对体外培养的血管内皮细胞增殖的作用,探讨川芎嗪的作用机制。 1材料与方法 1.
3、1实验试剂 盐酸川芎嗪注射液,由无锡市第七制药有限公司生产,规格为40mg/2mL,批号010913。药物用培养基稀释至所需浓度。F12培养基(Gibco,美国);兔抗HIF-1α多克隆抗体(武汉博士德);胎牛血清(Gibco,美国);EBM-2BasalMeidum(北京毕特博)。免疫组化采用北京中山公司免疫组化试剂盒(二步法)。其他试剂皆为分析纯。 1.2BREC细胞的培养 取死后3h内健康牛眼(取自潍坊肉联厂),70%酒精浸泡,角膜缘后4mm剪开,剥出视X膜神经层,剪碎、匀浆,孔径80μm金属筛X过滤,洗脱液离心(1000r/min,7
4、min),0.02%胶原酶Ⅰ消化(37℃,1~2h),离心洗涤并收集细胞,接种于鼠尾胶原培养皿内,20%胎牛血清的M199和EBM-2混合培养液,放入37℃5%CO2培养箱培养。培养液次日更换继续培养。以后每3天换液1次。长至近融合状态时,用0.1%胰蛋白酶消化、传代细胞。血管内皮细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原检测法,纯度为90%以上[1]。 1.3细胞处理及分组 将对数生长期的BREC细胞分别以浓度1.5×105/mL细胞悬液接种于24孔培养板,置于37℃5%CO2培养箱内培养24h,细胞分为以下3组:F12培养基常规培养组(正常对照),模拟缺
5、氧组(加入终浓度125μmmol/L的CoCl2)和药物治疗组(加入含不同浓度川芎嗪20、40、120μg/mL),各组分别培养24h,每项指标每组各测6个培养孔,分别取平均值。 1.4培养上清液VEGF含量ELISA法测定 按照说明书步骤严格进行操作,在酶标仪波长492nm比色定量。所有标本均作双管检查,对VEGF含量在标准曲线最高值以外的标本稀释10~100倍后重新测定。 1.5PA免疫组化 -10℃甲醇固定培养细胞5min,用3%H2O2孵育5min后冲洗,加入1∶100稀释的一抗于4℃过夜,洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体
6、,37℃孵育20min,PBS洗后以DAB显色。阴性对照以PBS液代替一抗。结果以胞核内有棕黄色颗粒为阳性判定标准,高倍镜下(×400)随机选择每张切片5个视野,采用计算机图像分析系统进行灰度分析。 1.6细胞内ATP含量测定 培养孔中加入煮沸的PBS3mL,振荡后立即吸入试管中,沸水浴10min后冰水冷却,低温离心13000r/min15min,将上清液试管置于冰水中待测。反应杯中加入样品0.2mL,放入荧光光度计反应暗室,微量进样器向反应杯中注入荧光素-荧光素酶液0.8mL,测定相对发光强度。按绘制好的ATP标准曲线计算出ATP含量。 1
7、.7HIF-1α免疫荧光染色 -10℃甲醇固定培养细胞5min,冲洗后,0.3%H2O2吐温30min,PBS洗3次,1∶100稀释的RABBITAnti-HIF-1α细胞于4℃过夜,洗后滴加FITC标记山羊抗兔IgG抗体,37℃孵育60min,PBS冲洗细胞后于荧光显微镜下观察。阴性对照以PBS液代替一抗。结果判定以细胞核或胞浆呈绿色荧光为阳性标准,每张切片随机选择5个视野在高倍镜下(×400)采用计算机图像分析系统进行荧光分析。 1.8数据处理 应用SPSS10.0统计分析软件包进行。数据均以均数±标准差(x±s)表示,组间比较用t检验。
8、P<0.05表示差异有统计学意[]目的研究川芎嗪对缺氧时体外培养的牛眼视X膜血管内皮细胞(BREC)VEGF表达及细
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