柴胡皂苷a人工抗原的合成及免疫原性鉴定

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1、柴胡皂苷a人工抗原的合成及免疫原性鉴定武汉市黄陂区中医医院430300【摘要】目的建立人工合成柴胡皂苷a的方法，为其进一步的研究奠定基础。方法通过高碘酸钠法合成SSa-BSA和SSa-PLL,利用薄层色谱法鉴定抗原是否合成成功，EUSA法鉴别抗原是否有免疫原性。结果经薄层色谱鉴定，SSa抗原合成成功，EUSA法测得合成的人工SSa抗原效价达:L80000。结论高碘酸钠法合成SSa人工抗原，操作简单，利用合成的抗原可用于进一步建立免疫分析方法。【关键词】柴胡皂苷抗原合成免疫原性［Abstract］ObjectiveSyntheticSaikosaponinest

2、ablishamethodforthefurtherresearchfoundation.ThemethodofsynthesisbysodiumperiodateSSa-BSAandSSa-PLL,theuseofthin-layerchromatographytoidentifywhetherthesyntheticantigensuccess,ELISAAntigenIdentificationofwhethertheimmunogenicity.ResultsidentifiedbyTLC,SSaantigensynthesissuccess,meas

3、uredbyELISAwassynthesizedartificialSSaantigentiterof1:80,000.ConclusionSynthesisofsodiumperiodateSSaartificialantigen,simpleoperation,theuseofsyntheticantigenscanbeusedforfurtherdevelopmentofimmunoassaymethods.【Keywords】Saikosaponinimmunogenicantigensynthesis中药柴胡活性最强的成分为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，

4、药理活性研究表明，柴胡皂苷a(SSa)具有解热、抗病毒、抗内毒素、抗炎、保肝、免疫调节及抗肿瘤等作用［1］。目前对柴胡皂苷a的定量方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法及高效液相法［2］。近年来，随着生物技术的发展，免疫分析的方法逐渐应用于中药活性成分的研究，木实验建立了SSa的免疫分析方法，合成了柴胡皂苷a人工抗原并对其进行了免疫原性的鉴定。1实验材料1.1试剂与仪器柴胡皂苻a，南京泽郎公司提供；牛血清蛋白、多聚赖氨酸由美国Roche公司提供；甲醇、乙酸乙酯为分析纯，由北京化工厂提供；试验用96孔酶标板由美国康宁公司提供；硅胶G板由青岛海洋分工厂分厂提供；DU

5、800紫外可见分光光度计厂家为德国Beckman公司。1.2动物SPF级Balb/c小鼠12只由维通利华实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-（京）2007-004,动物合格证号为N0.00297292实验方法2.1柴胡皂苷a人工抗原的合成本实验采用高碘酸钠法［3］合成柴胡皂苷a人工抗原，精密称量lO.Omg柴胡皂苷a于烧杯中，加入lml甲醇使其充分溶解；5.0mg高碘酸钠充分溶解于lml的蒸馏水中，倒入装冇柴胡皂苷的烧杯中，放入磁力搅拌器的转子后密封烧杯，在包裹锡纸避光，在室温下搅拌反应lh后，得到SSa的氧化产物，为A液。准确称量牛血清白蛋白（BSA）

6、、多聚赖氨酸（PLL）各lO.Omg,分别充分溶解于lml的0.05mol八pH为9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）,称为B液。用lmol/L的Na2CO3溶液将A液pH调至9.6后缓缓加至B液中，在密封避光条件下室温搅拌反应6h。得到的反应液转移至用蒸馏水预处理的透析袋中，透析3天，期间多次换液。得到的透析产物分装后，置于-2CTC保存。2.2柴胡皂苷a人工抗原及免疫原性的鉴定2.2.1薄层色谱法用甲醇配制适宜浓度的SSa标准溶液，用蒸馏水配制适宜浓度的BSA、PLL标准溶液，将待测样品SSa-BSA及SSa-PLL用蒸馏水稀释到适宜浓度，将标准溶液与待测样品分

7、别点同一硅胶G薄层板上，用乙酸乙酯-甲醇-水（8:2:1）为展开剂［4】进行展开，展开后晾干，用10%硫酸-乙醇溶液显色。2.2.2动物免疫饲养9周的BALB/c小鼠12只，随机选取3只不免疫，其余9只随机分为3组，用SSa-BSA免疫，具体方法如下：初次免疫，免疫剂量100μg/只,将乳化好的抗原进行背部皮下多点注射（0.1ml/只）；两周后进行加强免疫，背部皮下多点注射，0.1ml/只；此后每两周按上述方法加强免疫一次，第9周断尾取血，血液在37°C下放置30min，4°C3000rpm,离心lOmin，取上清-20°C保存待用。2.2.3ELISA

8、法测定血清中的抗体效价以柴胡皂苷a-P