缅甸蝰蛇毒纤溶酶fⅱaa的分离及生物活性

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1、缅甸蝰蛇毒纤溶酶FⅡaa的分离及生物活性：陈慧珍，梁秀霞，邱鹏新，陈家树【摘要】【目的】从缅甸蝰蛇毒中分离纯化得到纤溶酶FⅡaa并研究其纤维蛋白溶解活性。【方法】缅甸蝰蛇蛇毒纤溶酶FⅡaa经过离子交换层析和凝胶层析分离程序得到，SDS-PAGE电泳测得其分子质量，用纤维蛋白平板法测得其纤维蛋白溶解活性，SDS-PAGE电泳测得其纤维蛋白原和纤维蛋白水解特异性。通过小鼠背部皮下注射FⅡaa测定FⅡaa的局部出血活性。取昆明种小白鼠42只，体质量(20±2)g，雌雄各半，随机分成7组，每组6只，皮下注射0.1mL的FⅡaa(5个

2、剂量组：用生理盐水配制成浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mg/mL)，生理盐水和粗毒(0.1mg/mL)做对照。6h后处死小白鼠，从皮内侧面测量出血点的大小，计算最小出血剂量(MHD)。【结果】通过三步分离方法得到蛇毒纤溶酶FⅡaa，其分子质量是69000u。FⅡaa在纤维蛋白平板和加热纤维蛋白平板上均显示了纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白原和FⅡaa(0.2g/L)保温后，Aα和Bβ链分别在5min和6h后完全水解。γ-链在24h后部分水解。FⅡaa水解纤维蛋白的过程与纤维蛋白原的水解过程相似。蛇毒

3、纤溶酶FⅡaa(0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mg/mL)的皮内出血点直径(mm)分别为7.7±1.0、9.9±1.4、10.5±1.8、12.7±1.4、13.5±1.3。最小出血剂量(MHD)为6.0μg。【结论】FⅡaa是一种可以直接降解纤维蛋白且具有出血活性的α-纤维蛋白酶。【关键词】纤溶酶;蛇毒;蝰蛇　Abstract：【Objective】TopurifyFⅡaa，afibrinolyticenzymefromBurmeseRussell’sViper(DaboiaRusselliSiame

4、nsis)venom，andinvestigateitsfibrinolyticcharacterization.【Methods】FⅡaaBurmeseRussell’sVipervenombyion-exchangechromatographyandgel-filtration.Molecularinedbysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE).Fibrinolyticactivityinedusingfibrinplatestec

5、hnique.Specificcleavageoffibrinogenandfibrinorrhagicactivityouse.42Kunmingstrainmice(20±2)g，bisexualeachhalf，lydividedinto7groupsplesin0.1mLof0.9%saline，bycontrolof0.9%salineandcrudevenomandsacrificedafter6hoursandthediametersofhemorrhagicspotsmeasuredontheundersid

6、eoftheskin.【Results】FⅡaaolecularinand6hrespectively.Theγ-chainilartothatobservedeters(mm)ofhemorrhagicspotsmeasuredontheundersideoftheskinofbin-likeenzymes)、血浆纤溶酶原激活物(Plasminogenactivators)和纤维蛋白(原)溶解酶(以下简称纤溶酶)，三者统称纤维蛋白原水解酶[2]。这些酶中只有纤溶酶能够直接降解纤维蛋白和纤维蛋白酶原。目前大约有70多种具有或

7、者不具有出血活性的纤溶酶被分别从Agikistrodonacutus[3]、Agikistrodoncontortrix[4]、Cerastescerastes[5]、Trimeresurusmucrosquamarus[6]、Viperalebetina[7]、Crotalusatrox等[8]蛇毒中分离出来并进行了性质研究。蝰蛇是世界上的主要毒蛇之一，蝰蛇(缅甸亚种)属于蝰科蝰亚科，主要分布于东南亚的十几个国家和地区[9]。蝰蛇毒中含有丰富的血液毒素，至今已从其中分离出多种凝血毒素，如凝血因子Ⅹ激活剂(RVV-Ⅹ)、凝血

8、因子Ⅴ激活剂(RVV-Ⅴ)[10-12]和凝酯酶A2[13-15]和出血蛋白酶[16]、蛋白酶抑制剂[17]。目前国内外均未见同种蛇毒纤溶酶的研究报道。仅Chakrabarty等[16]从蝰蛇(缅甸亚种)毒中分离出一种具有纤溶活性和酯酶活性的出血因子VRR-73，其通过激活纤溶酶原降解纤维