烙铁头蛇毒纤溶组分fⅵaa的分离纯化、生化特征及生物活性研究

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1、中山大学硕士学位论文烙铁头蛇毒纤溶组分FVIaa的分离纯化、生化特征及生物活性研究烙铁头蛇毒纤溶组分FVIaa的分离纯化、生化特征及生物活性研究硕士生：李敏妍导师：陈家树教授专业：药理学摘要血栓性疾病因其较高的发病率、致残率和死亡率，严重危害人类健康。临床上亟需安全有效、特异性强、无出血副作用、价格合理等特点的溶栓药物。蛇毒纤溶酶可以直接降解纤维蛋白，不依赖血纤溶酶原的激活，出血副作用小，已有制剂用于临床。烙铁头蛇毒液富含血液循环毒素，尤其是纤维蛋白(原)溶解组分，本课题致力于从烙铁头蛇毒中分离出一种新的高效低毒的纤溶组分。烙铁头蛇粗毒经过

2、三步层析首次得到了一个分子量为23301Da的单链金属蛋白酶FⅥaa，该组分能高效水解纤维蛋白原的An链及B8链；能直接降解纤维蛋白；最小出血剂量为1．08mg。同本实验室已成功提纯的五步蛇毒纤溶组分FIIa比较，FVIaa降解纤维蛋白的活性更强，无出血毒性作用。本实验详细介绍了烙铁头蛇毒组分FVIaa的分离提纯过程及部分生化、生物活性研究。方法：1．通过CMSephadexC-50阳离子交换层析，DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG．50fine凝胶过滤层析三步从湖南产烙铁头蛇毒中分离纯化目的组分F

3、VIaa。2．SDS．PAGE鉴定纯度。3．质谱4000QTRAP测定分子量。4．等电聚焦电泳测定等点电。5．采用偶氮酪蛋白水解法测定FVIaa对蛋白底物的水解活性。6．采用纤维蛋白平板法测定FVIaa对牛纤维蛋白的降解活性。中山大学硕士学位论文烙铁头蛇毒纤溶组分FVI姐的分离纯化、生化特征及生物活性研究7．采用普通平板和加热平板比对的方法，了解FVIaa与UK降解纤维蛋白原理的异同。8．采用SDS．PAGE的方法观察FVIaa对牛纤维蛋白(原)的降解方式。9．偶氮酪蛋白法测定不同温度、不同pH、不同浓度金属离子和抑制剂对FVIaa酶活性的

4、影响。10．按照Kondo的方法，小鼠背部皮下注射不同浓度的FVIaa，分析其出血毒性。结果：1．粗毒经CMSephadexC．50阳离子交换层析得到7个蛋白峰，其中第4峰(FIV)和第6峰(FVI)具有较强的纤溶活性。FⅥ再经DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析得2个蛋白峰，其中第l峰有纤溶活性，将其再过SephadexG．50fine凝胶过滤层析得1个蛋白峰，即为目的组分。2．SDS．PAGE达到电泳纯，结果显示为一单链蛋白质，质谱测定精确分子量为23301．0Da，等电点主带9．09。3．FVIaa具有蛋白水解活性

5、，可水解纤维蛋白原，优先降解AQ链，呈时效、量效关系；可直接降解纤维蛋白，不依赖于纤溶酶原的激活。4．FVIaa为金属蛋白酶，EDTA和D1vr可显著抑制其活性，PMSF和抑肽酶对活性几乎无影响；M92+、Ca2+可增强FVIaa的酶活性，而Cue+、Zn2+、C02+可抑制其活性。酶的适宜pH为8．0．11．0，适宜温度为30．50℃。5．FVIaa的最小出血剂量为1．08mg。小结：1．通过CMSephadexC一50阳离子交换层析，DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG．50fine凝胶过滤层析三

6、步从湖南产烙铁头蛇毒中分离纯化目的组分叫VIaa，回收率为0．78％。2．FVIaa为单链金属蛋白酶，分子量为23301．0kDa，等电点9．09左右。3．FVIaa能水解纤维蛋白和纤维蛋白原，作用呈量效、时效关系，优先降解Q链。蛋白水解作用的适宜pH为8．0．11．0，适宜温度为30—50。C。II中山大学硕士学位论文烙铁头蛇毒纤溶组分FVlaa的分离纯化、生化特征及生物活性研究4．FVI匏为非出血性蛇毒纤溶酶。关键词烙铁头蛇；FVIaa；纤溶；金属蛋白酶IⅡ中山大学硕士学位论文烙铁头蛇毒纤溶组分FⅥaa的分离纯化、生化特征及生物活性研究

7、Purification，biochemicalandbiologicalCharacterizationoffibrinolyticcomponentFVIaafromTrimeresurusmucrosquamatusvenomName：LiMinyanSupervisor：ProLChenJiashuMajor：PharmacologyAbstractThrombosisisonekindofdiseasesthatthreatenhumanhealthseriouslybecauseofitshighincidence，morbid

8、ityandmortality．Itisurgenttolookforakindofdrugsthatissafe，effective，specific，non—hemorrag