抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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1、抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定1.文献综述2.单抗的制备与鉴定目的意义材料方法结果与分析3.讨论1.文献综述1.1流感的病原学流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科－A型、B型流感病毒属和C型流感病毒属A型流感病毒亚型－HA:16－NA:10高致病性禽流感(HPAI)--H5andH71.2流感病毒检测技术1.2.1病毒的分离鉴定1.2.2血清学诊断技术血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验琼脂凝胶扩散试验（AGID）神经氨酸酶抑制试验（NIT）病毒中和试验（NT）免疫荧光技术（IFT）酶联免疫吸附试验（ELISA）1.2.3分子生物学诊断技术PCR诊断技术实时荧光定

2、量PCRNASBA法核酸探针技术M检测法基因芯片技术2单抗的制备与鉴定2.1研究目的与意义流感是第一个实行全球监控的传染性疾病。对人及禽、畜的危害十分巨大。除禽流感外，常见的还有人流感、马流感和猪流感等。动物流感尤其是禽流感与人类流感和人类健康非常密切，禽流感被认为是人流感病毒的保存和发生变异的新基因的来源，这种联系是通过中间宿主来实现的。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能将流感病毒传播给人。2.1研究目的与意义流感的监控工作是预防与控制该病的一个重要环节。国内对流感病毒的临床诊断主要是对抗体的检测。病毒抗原检测方面，虽然病毒的分离鉴定是诊断禽

3、流感的一种可靠方法，但病毒的分离鉴定、动物接种试验操作复杂，周期长，难以满足对高致病性禽流感快速诊断的需要。聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针等方法则需要较好的试验条件和较高的人员素质，目前还难以广泛推广。流感病毒的HA蛋白具有亚型特异性，但NP蛋白却相对保守。利用NP蛋白和HA蛋白分别有望建立一种所有亚型禽流感病毒的检测方法和诊断流感病毒亚型的方法。而单克隆抗体由于由于特异性以及高度亲和力，用于病毒学诊断时相较于多抗有许多优点。本研究利用杂交瘤技术获得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗，为对禽流感病毒的进一步研究和建立针对所有亚型禽流感病

4、毒和H3亚型的检测方法奠定基础。2.1研究目的与意义2.2材料方法2.2.1细胞、病毒与动物SP2/0骨髓瘤细胞系由本实验室保存。流感病毒H9N2、H1N1由本实验室分离鉴定，保存。H3N8由哈尔滨兽医研究所提供。新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、产蛋下降综合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）购自北京梅里亚维通公司。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司。BALB/C小鼠购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。2.2.2培养基及主要试剂RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完

5、全与不完全佐剂：GIBCOL公司。新生小牛血清（超级）：四季青生物工程公司。精制小牛血清：Hyclone公司。融合剂50％PEG（P7181）、羊抗鼠IgG-HRP、8－氮鸟嘌呤：SIGMA公司。羊抗鼠IgG1、G2a－HRP：SBA公司。青、链霉素：华北制药厂。2.3.3方法病毒粒子的大量制备与纯化免疫原的制备动物免疫SP2/0骨髓瘤细胞的活化与制备免疫脾细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞上清检测杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）杂交瘤细胞染色体数的检测单克隆抗体的生产、纯化和效价测定单克隆抗体亚类鉴定单抗特异性鉴定间接免疫荧光法检测单克隆抗体2.3.3方法2.3结果

6、与分析2.3.1抗NP蛋白杂交瘤细胞的筛选用间接ELISA方法进行筛选。使用A法免疫制备了1株抗NP蛋白的单抗1D10，使用B法获得了4株单抗（4F4、1C3、1G11、1C2），使用C法获得了1株单抗(2E7)。各株单抗用间接ELISA方法的检测结果如表2－1所示，其中1D10和1G11效价最高，用于以下的试验。抗NP杂交瘤细胞上清ELISA检测结果(OD630)Antigens1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.5130.456H9N2

7、0.9750.4190.3620.6870.3670.386阴性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示没有检测；所建立的ELISA临界值均为0.2。2.3.2抗HA蛋白杂交瘤细胞的筛选通过血凝抑制试验进行筛选。经2次检测、3次克隆后获得3株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，连续培养数月，细胞生长良好，反复冻存复苏后，仍保持稳定的抗体分泌能力，分别命名为2B7、1C11、4G7。2.3.3杂交瘤细胞染色体数的检测杂交瘤细胞染色体计数结果

8、见表2－2。2.3.4单