抗禽流感病毒m2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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1、抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定【摘要】目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法:利用纯化的融合蛋白GSTM2免疫BALB/c小鼠,然后以GSTM2和GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GSTM2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIVM2mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验（AGP）测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3和5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP

2、效价大于1∶4。抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2F8和5G6为IgG2b。抗原捕获ELISA表明,2F8mAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒（NDV）和鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）反应。IFA和免疫组化试验表明,2F8mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合。结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂。【关键词】禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体禽流感病毒的基因组由8个单股RNA片段组成,这种多节段性的特点决定了基

3、因组除本身易发生基因突变、小片段基因重组外,还特别易与禽流感病毒、猪流感病毒或人流感病毒等进行完整片段的基因重排,因而禽流感病毒亚型众多,变异性极强[1,2]。自1878年意大利首次报道禽流感发生以来,禽流感相继在世界各地暴发,而且不断出现新的亚型和变异株,以致于1997年香港及2004年南亚地区发生了感染人的事件[3,4]。我国自1993年在鸡、鸭、鹅、鸽、珍禽中分离到禽流感病毒以来,鸡群中已存在H9、H5、H7及H14等多个血清亚型,给我国养禽业构成极大威胁。因此加强禽流感疫情监测工作特别重要,尤其是定期、持续、监测和及时、准确的预测预报,只有如此,

4、才能将禽流感尤其是高致病力禽流感消灭在萌芽状态。2002年,秦爱建等报道,利用杂交瘤技术获得了抗AIV的H5和H9亚型血凝素特异性的单克隆抗体(mAb)[5],并建立了诊断高致病性毒株H5和低致病性H9亚型病毒的方法,使检测结果更加准确可靠。尽管如此,只能对在一定时期内发生特定亚型（如H9或H5）禽流感病毒感染时具有鉴定作用,无法对可能发生的新变种的禽流感病毒感染做出诊断。因此研究一种可广泛检测禽流感病毒的方法,对提高人们在疫情预测预报方面的能力很有帮助。M2蛋白是禽流感病毒中高度保守的蛋白,它在禽流感病毒各亚型的不同毒株之间都具有很高的同源性,因此可用

5、于所有禽流感的诊断中[6,7]。本研究中,我们利用获得的高度纯化的融合蛋白GSTM2作为免疫原免疫BALB/c小鼠,然后运用杂交瘤技术,来研制抗禽流感病毒M2蛋白mAb,以期为建立快速准确诊断禽流感病毒感染的方法奠定基础,进而为该病的大流行预警预报提供技术保证,也为及时扑灭和防止疫情的扩散提供科学依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　8周龄雌性BALB/c小鼠,由军事医学科学院实验动物中心提供;骨髓瘤细胞系Sp2/0由中国农业大学动物医学院传染病教研室提供。　　DMEM、HAT、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）均为Invitrogen公司产品;辣根过氧

6、化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG、弗氏佐剂、HRP标记羊抗鸡IgG、PEG1450、FITC标记的羊抗小鼠IgG以及鼠源mAb亚类试剂盒均为Sigma公司产品;优级胎牛血清为Hyclone公司产品。禽流感病毒:AIVA/goose/Guangdong/96(H5N1)、AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)由国家流感中心提供。鸡传染性法氏囊病病毒BJ836株（IBDV）、鸡新城疫病毒（NDV）LaSota株,抗H9N2、H5N1的AIV,抗IBDV、NDV的SPF鸡血清及阴性血清由本研究所保存。　　1.2方法　　1.2.1抗原的制

7、备　　利用本研究所构建原核表达载体pGEXM2（M2基因于AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)）以及pGEX5X1在大肠杆菌中BL21诱导表达,获得的可溶性产物用GlutathineSepharose4B（AmershanPharmacia产品）进行亲和层析得到纯化的融合蛋白GSTM2及GST蛋白。融合蛋白GSTM2已被证实保留了天然AIVM2蛋白的免疫原性,可作为本研究的免疫原[8,9]。　　1.2.2动物免疫　　首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原,间隔3周后,采用弗氏不完全佐剂乳化抗原,背部皮下多点注射8周龄BALB/

8、c小鼠,如此进行第3、4次免疫并用ELISA检测每只小鼠的抗体水平。第4次免疫间