抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定-论文.pdf

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1、第34卷第6期西安交通大学学报(医学版)Vo1．34NO．62013年11月JournalofXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences)Nov．2O13抗鸭乙肝病毒core蛋白单克隆抗体的制备与鉴定王亚文，刘正稳，张琳，冯艾，王威，王全颖。，杨广笑。，惠凌云(1．西安交通大学医学院第一附属医院检验科，陕西西安710061；2．西安交通大学医学院第一附属医院传染科，陕西西安710061；3．西安华广生物工程有限公司，陕西西安710040)摘要：目的制备抗鸭乙肝病毒core蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。方法PCR扩增鸭乙肝病毒(DHBV)cor

2、e基因片段，构建表达载体pET28a(+)／DHBVcore。转化诱导表达融合蛋白，用Ni亲和柱纯化目的蛋白。免疫Balb／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，ELISA筛选，采用有限稀释法筛选单克隆杂交瘤细胞并进行细胞克隆。体内诱生法大量制备单克隆抗体，进行抗体的特异性、效价和亚型的鉴定。结果成功构建表达载体pET28a(+)／DHBVcore，并表达DHBVcore蛋白。获得2株稳定分泌抗DHBVcore抗体的杂交瘤细胞株，分别为2D7和5G10，细胞培养液抗体效价为1：400和1：800。选择5G10细胞株制备单克隆抗体，小鼠腹水抗体效价可达1：320000。鸭

3、肝组织免疫组化结果显示，DHBV病毒载量>i0copies／mg的肝组织中DHBVcore蛋白的表达明显高于病毒载量<10copies／mg的肝组织，而未感染DHBV的鸭肝细胞内不表达DHBVcore蛋白。亚型鉴定结果为IgG2a链。结论制备并获得了抗DHBVcore蛋白的单克隆抗体，为DHBVcore蛋白的功能研究、诊断试剂的研制与抗病毒治疗研究奠定了基础。关键词：鸭乙肝病毒；核心蛋白；单克隆抗体；细胞克隆中图分类号：Q78；R392文献标志码：A文章编号：1671—8259(2013)06—0768—05DOI：10．7652／jdyxb201306014Preparat

4、ionandidentificationofduckhepatitisBviruscoreproteinmonoclonalantibodyWANGYa—wen，LIUZheng—wen，ZHANGLin，FENGAi，WANGWei，WANGQuan—ying。，YANGGuang—xiao。，HUILing—yun(1．ClinicalLaboratory，theFirstAffiliatedHospital，MedicalSchoolofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061；2．DepartmentofInfectiousDisease

5、s，theFirstAffiliatedHospital，MedicalSchoolofXi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061；3．Xi’anHuaguangBiologicalEngineeringCompany，Xi’an710040，China)ABSTRACT：ObjectiveToprepareandidentifymonoclonalantibodiesagainstduckhepatitisBvirus(DHBV)coreprotein．MethodsDHBVcoregenewasamplifiedbyPCRtoconstruct

6、arecombinantplasmidpET28a(+)／DHBVcore．TherecombinantplasmidwasexpressedinE．coliBL21inducedbyIPTGandDHBVcoreproteinpurifiedbyNiaffinitychromatographywasusedtoimmunize8-week-oldfemaleBalb／cMusmusculson．ThenafterfusionbetweenspleencellsstimulatedandSP2／0myelomacell，thehybridomacloneagainstDHBV

7、coreproteinwasobtainedbylimiting·dilutionmethodandELISAassay．Alargenumberofantibodieswereinducedinvivo．ThespecificityoftheantibodieswasidentifiedbyELISAassayandimmunohistochemistry．ResultsRecombinantplasmidpET28a(+)／DHBVcorewasexpressedsuccessfullyinE．co