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时间:2018-09-11
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1、HIF.1a反义脱氧寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及HIF.1a、VEGF表达的影响硕士研究生:于海华指导教师:韩璐教授专业名称:妇产科学摘要背景:近年来,反义技术广泛地应用于肿瘤基因治疗的研究中,随着基因组学、蛋白组学的研究,已筛选出部分在肿瘤转化、发展过程中的靶基因可作为治疗的靶标。有学者发现,缺氧诱导因子.1a(HIF.1a)是介导肿瘤细胞缺氧适应的关键性转录调控因子,在多种恶性实体瘤中高表达。HIF.1a可调节多种靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(EPO)等的表达,维持肿瘤细胞的能量代谢,影响新血管的生成,
2、促进肿瘤的增殖和转移。血管内皮生长因子(VEGF)在内皮生长及肿瘤发生中具有重要作用,肿瘤的生长和扩散转移与血管生成密切相关。因此,HIF.1a可能是肿瘤基因治疗中一个极具潜力的靶点。目的:应用HIF—la反义脱氧寡核苷酸(ASODN)来处理体外培养的宫颈癌Hela细胞,研究反义脱氧寡核苷酸封闭HIF一1Q基因对体外宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF.1d、VEGF表达的影响,力求为今后进行针对HIF.1d的妇科肿瘤基因治疗探寻一条新的可行途径。方法:1、对体外培养的宫颈癌Hela细胞进行转染。实验分为HIF一1n反义脱氧寡核苷酸(ASODN
3、)组、HIF.1n正义脱氧寡核苷酸(SODN)组、脂质体对照组及空白对照组。2、采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,检测HIF一1aASODN对体外宫颈癌Hela细胞株增殖的影响。3、应用间接免疫荧光技术检测ASODN组、SODN组、脂质体对照组及空白对照组细胞HIF.1Q和VEGF的表达。4、逆转录一聚合酶链反应(RT—PeR)检测各组细胞HIF—lQ和VEGFmRNA的表达。5、蛋白印迹(Westernblot)技术检测各组细胞HIF—la和VEGF的蛋白表达t了解HIF-la基因的沉默效果。6、所得数据应用SPSSll.5统计分析软件进行分析
4、。结果:1、反义脱氧寡核苷酸(ASODN)转染后24hBl3对宫颈癌Hela细胞发生明显的生长抑制作用,与正义脱氧寡核苷酸(SODN)组、脂质体(LIPOFECTAMINETM2000)对照组比较,抑制率差异有统计学意义(P均<o.01)。反义脱氧寡核苷酸(ASODN)对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用呈现剂量依赖性,随药物浓度增加抑制作用增强。2、RT.PCR及Westernblot结果显示,ASODN处理组细胞HIF.1a及VEGF基因表达与SODN组、脂质体对照组及空白对照组比较,表达量明显降低,差异有统计学意义(P<O.05)。结果表明AS
5、ODN特异性抑制了HIF一1Ⅱ的基因表达。3、间接免疫荧光技术检测HIF.1旺在胞浆及胞核中均着色,而VEGF着色主要分布在胞浆。ASODN处理组细胞HIF.1缸及VEGF的荧光强度均明显弱于对照组,说明ASODN对HIF—la及VEGF的表达有明显的抑制作用。此结果与RT.PCR及Westernblot的分析结果一致,进一步为ASODN对HIF—la¥[IVEGF的基因表达具有抑制作用提供了实验依据。结论:1、HIF.Ia在胞浆及胞核中均表达,而VEGF仅在胞浆中表达。2、脂质体转染HIF.1。ASODN具有明显抑制富颈癌Hela细胞的增殖活性及下
6、调HIF.1o、VEGF基因表达的作用。3、HIF.1ⅡASODN转染可以作为宫颈癌治疗的一种新思路。关键词:宫颈肿瘤缺氧诱导因子一1Hela细胞反义脱氧寡核苷酸血管内皮生长因子InhibitionofHelacellgrowthandtheexpressionofHIF-1nandVEGFbyantisenseoligOdexynucleOtidetargetinghypoxiainduciblefactorlageneMasterdegreecandidate:YuHaihuaSupervisor:ProfessorHartLuMajor:G
7、ynaecologyandObstetricsAbstractBackground:Recently,antisensetechnologyWaSgenerallyappliedtotheresearchoftumourgenetheraphy.Witllthedevelopmentofgenomi'csandproteomicsSomeoftargetgenewasscreenedoutinthecourseoftransformationanddevelopmentoftumour.someauthordiscovertha
8、tHIF-lamaybethekeytranslator-factortoadaptthehypoxiaco
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