罗格列酮对梗阻性肾病肾组织血小板反应蛋白表达影响

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华中科技大学硕士学位论文Theeffectofrosiglitazoneontheexpressionofthrombospondin-1intheratwithunileralureteralobstructionPostgraduateInstructorGuoChengkunProf.LvYongmanABSTRACTObjetiveToinvestigatetheeffectofrosiglitazone(RSG)onrenalinterstitialfibrosisaswellasitspotentialmechanismsintheratwithunilateralureteralobstruction.Methodsratswererandomlydividedintosham,UUOandRSGgroups.RatssubjectedtoUUOweretreatdedwithoraladministrationofrosiglitazoneat30mg/kg.dorvehicleatthetimeof48hoursbeforetheoperationuntilbeingsacrificed.Groupsof6ratswerekilledatthreetimepoints--day3、day7、day14.Thepercentageofrenaltubularlesion,interstitialfibrosisscore,thelevelofnitricoxide,tubulointerstitialthrombospondin-1expressionwereassessdedandcomparedwithUUOandshamgroups.ResultsRosiglitazonetreatmentgreatlyreducedtubularlesionandattenuatedinterstitialfibrosis.ThelevelofnitricoxideinthekidneyingroupstreatedwithrosiglitazonewerehigherthanthatinUUOgroupsduringtheexpriment(p<0.05).Inaccordancewiththelevelofnitricoxide,theexpressionofthrombospondin-1wasdownregulatedsignificantlyinthegroupstreatedwithrosiglitazonecomparedwithUUOgroups.ConclusionsRosiglitazonesupressestubulointerstitialfibrosisbypromotingnitricoxidereleaseintheratwithunilateralureteralobstructionintheearlystage,whichisabletoinhibittheexpressionofthrombospondin-1.KeywordsRosiglitazoneNitricOxideThrombospondin-13 华中科技大学硕士学位论文罗格列酮对梗阻性肾病肾组织血小板反应蛋白1表达的影响前言肾间质炎症和纤维化是各种慢性肾脏疾病进行性损害的共同病理特征之一，是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾病（ESRD）的共同通路，肾小管间质损害的程度与肾小球滤过率（GFR）呈明显的负相关，而且比肾小球病变更能预测预后（1-3）。因此如何防止肾间质纤维化的形成一直是肾脏病领域研究的热点问题。导致肾间质纤维化的主要原因是肾脏局部胶原纤维的合成代谢超过分解代谢。既往大量研究表明转化生长因子β（TGF-β）是导致肾脏胶原代谢失衡的主要影响因子，全身组织分泌的TGF-β主要以潜在相关肽-转化生长因子β（LAP-TGFβ）复合物形式存在，而TGF-β在该复合物中无活性，必须经一系列转化被激活才能发挥其生物学功能（34）。研究表明血小板反应蛋白1（TSP-1）是LAP-TGF-β复合物的主要生理性激活剂，它通过变构效应引起该复合物结构改变从而激活TGF-β（35）。在体内TSP-1的表达受一氧化氮（NO）的调节，Wang研究发现NO通过NO-cGMP-PKG途径可以减少高糖环境中培养的系膜细胞TSP-1的生成，同时减少系膜细胞合成胶原蛋白Ⅲ（8）进肾脏NO的释放可能能够防止肾脏纤维化。Polikandriotid研究发现过氧化物酶体增值激活受体λ（PPAR-λ）的天然配体15d-PGJ2和环格列酮（ciglitazone）及罗格列酮（rosiglitazone)同PPAR-λ结合后能够促进脐静脉内皮细胞释放NO并提高内皮细胞NO的利用率（7）。罗格列酮是人工合成的PPAR-λ激动剂，主要用于治疗2型糖尿病，最近研究发现罗格列酮除了能够增加组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗，调节血糖和血脂等代谢紊乱作用之外，还具有抗炎，影响细胞增殖和转型以及抗脏器纤维化的作用(4-6)。因此本实验借助单侧输尿管结扎模型（UUO）研究罗格列酮是否通过促进梗阻侧肾脏NO的释放，下调TSP-1的表达，从而减少胶原蛋白的合成，防止肾间质纤维化的形成。4，表明促 华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、材料1、实验动物54只健康雄性Wistar大鼠，体重180-220g（购自华中科技大同济医学院实验动物中心）。2、实验器材与试剂2.1实验器材一次性试管、EP管（1ml0.2ml）、玻片、玻片架、玻片盒、加样枪、三角瓶、冰盒、匀浆器、脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、超低温冰箱、低温离心机、分析天平、PCR扩增仪、水平电泳仪、恒温水浴箱锅、UV751GD紫外／可见分光光度计、HMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统、JS-380自动凝胶图像分析仪。2.2主要试剂及配制1）PBS缓冲液（0.01mMPH7.2）KCL0.2g、KH2PO40.2g,NaCL8.0g,Na2HPO4.12H2O1.54g,加双蒸水至1000mL,10%NaHCO3调至PH7.22）枸橼酸盐缓冲液0.01mMPH6.0A.0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸溶于1000ml蒸馏水中。B.0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠溶于1000ml蒸馏水中。工作液：0.1取9mlA液和41mlB液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值为6.03）5*TBE液Tris-碱30.25g，EDTA0.93g，硼酸12.84g，加500ml蒸馏水工作液为0.5*TBE4）4%多聚甲醛称取多聚甲醛4g，加蒸馏水50ml，加热至60℃，搅拌并加入1mol/lNaOH数滴，直溶液澄清，冷却后用0.1mol/lPBS加至100ml。5）DEPC水加100ulDEPC于100ml水中，使DEPC的体积分数为0.1％。在37℃温浴至少12h，然后在约15个大气压条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。6）Trizol美国Invitrogen生产，RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶及其反应缓5 华中科技大学硕士学位论文冲液TakaRa公司生产、多聚赖氨酸Sigma公司生产、分析用氯仿、无水乙醇。7）Thrombospondin1小鼠抗大鼠单克隆抗体NeomarkerofAmerica生产8）SABC法免疫组化试剂盒晶美公司提供9）NO检测试剂盒南京建成生物工程有限公司10）文迪雅（马来酸罗格列酮葛兰素史克（天津）有限公司批准文号：国药准字H20020475）二、实验方法1、实验模型的建立将所有大鼠随机分为三组，假手术组（Sham组）18只,模型组（UUO组）18只，治疗组（RSG组）18只，所有大鼠自由饮水进食。各组模型建立方法如下：以10％水合氯醛O.3ml／kg腹腔麻醉，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，剪毛后常规碘酒酒精消毒，行左侧腹切口，暴露左肾，沿左肾下极寻找到左输尿管并游离，在离左肾下极0．3cm处用丝线上下结扎两道，然后在两道结扎点间剪断输尿管，逐层缝合。Sham组仅开腹并游离左侧输尿管，但不从中结扎和剪断。术前48hRSG组大鼠给予罗格列酮粉剂30mg／(kg・d)溶解于2ml生理盐水中灌胃，UUO组、Sham组同时以等量的生理盐水灌胃。每组大鼠分别于术后第3天、第7天、第14天各处死6只，心腔灌洗后留取左侧肾脏，分别置于4%多聚甲醛液固定和冻存管于超低温冰箱保存，以备进行肾组织免疫组化染色和mRNA的提取。2.检测方法2.1肾组织病理学检查肾组织经4%多聚甲醛固定梯度酒精脱水后进行石蜡包埋，然后切片，厚度约为3μm，最后切片脱蜡至水行HE和MASSON染色。对肾间质纤维化程度进行半定量评估，分值为0～4分。0分为正常；1分为肾间质纤维化面积不超过视野25％；2分为25％～49％；3分为50％～75％；4分为超过75％。计算30个肾皮质高倍视野(×400)，求和、取平均数，求得该动物肾间质纤维化分值。2.2制备肾组织匀浆，检测NO水平称取大约0.6g冷冻肾组织标本，入预冷的生理盐水中漂洗，滤纸滤干，称重后放6 华中科技大学硕士学位论文入5ml烧杯内。用移液管取总量生理盐水(生理盐水体积总量约为肾组织块重量的9倍)于烧杯中，用眼科小剪剪碎组织块(烧杯放人冰水中进行)，至预冷匀浆器内研至完全溶解，4℃静止30分钟，低温离心机离心3000g离心10分钟。取上清液，按照蛋白含量测定说明书加人试剂，利用UV751GD紫外／可见分光光度计(选取595nm，lcm光径)测量各组样本吸光度值(0D值1)，代入以下公式：蛋白含量（mg/L）=测量管OD1值/标准管OD1值*标准管浓度（mg/l）计算出肾组织蛋白含量。肾组织NO含量测定按照N0测试盒说明书加入试剂，再利用U51GD紫外／可见分光光度计(选取550nm，0．5cm光径)测量各样本吸光度值(0D2值)，与测得的各样本蛋白含量代入以下公式：NO含量（μmol/mgprot）=(测量管OD2值-空白管OD2值)/（标准管OD2值－空白管OD2值）*标准管的浓度/标本的蛋白含量计算出肾组织NO含量。2.3免疫组织化学方法检测TSP-1石蜡切片常规脱蜡至水，入0.01mMPH6.0枸橼酸盐缓冲液中微波加热至98℃-100℃30min修复抗原，冷却后至PBS缓冲液10min然后染色。染色步骤如下：⑴3％过氧化氢液15min消除肾脏内源性过氧化氢酶，PBS洗2min×3次⑵以5％BSA（小牛封闭血清）封闭20min，滤纸吸干液体⑶滴加小鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体(1：50），湿盒内置于4℃冰箱孵育过夜⑷PBS洗2min×3次，然后加入生物素化羊抗小鼠二抗，室温孵育10min，PBS洗2min×3次⑸滴加链霉素一生物素一辣根过氧化物酶复合物工作液，室温孵育30min，最后用DAB显色，显微镜下控制显色时间⑹最后以苏木素复染、脱水、透明、封片同时以PBS替代一抗做阴性对照。取各组标本的免疫组化切片，高倍镜下(400×)用计算机图像分析软件(HMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统)对所选视野内的免疫组化阳性信号进行计算机读片，以阳性染色区域的积分光密度值做半定量分析测定值。7 华中科技大学硕士学位论文2.4RT-PCR方法检测梗阻侧肾组织TSP-1mRNA组织RNA提取的实验步骤如下:①取新鲜冰冻组织块约100mg置于1.5ml无菌灭酶的EP管中，用无菌眼科剪将组织标本剪碎②加入1mllTrizol，用研磨棒研磨，并抽打匀浆(冰上操作)，室温放置5分钟③4℃，12000rpm，离心5min，上清夜移入1.5ml新离心管④加0.2ml氯仿，用力震荡15sec充分混合，室温静置15min⑤4℃，12000rpm，离心15min，上层水相移入新离心管⑥加0.5ml异丙醇，震荡混匀，室温放置10min，4℃、10000rpm离心10min沉淀RNA⑦弃上清液，加75%乙醇lml洗沉淀，4℃、8500rpm，离心5min⑧弃上清液，加入75%乙醇lml，一20℃保存紫外分光光度计测定RNA样品的OD26O和OD28O值，以观察所提取标本RNA的纯度，并计算其含量。RT-PCR步骤取上述提取RNA进行逆转录反应体系如下：反应体系如下：MgCl210×bufferdNTPRnaseMMV逆转录酶DEPC水Oligo（dT）RNA模板4.OμL2.0μL2.0μL0.5μL6.25μL0.25μL1.0μL4.0μL20.0μL8 华中科技大学硕士学位论文取2μL（约4μg）cDNA用于聚合酶链反应，扩增目的基因。TSP-1引物利用Primer5.0设计，由上海生物工程有限公司合成。TSP-1引物上游序列5ˊ-AAAGCGTCTTCACCAGAGACCT-3ˊ，下游序列5ˊ-GCAGATGGTAACTGAGTTCTGACA-3ˊ，扩增长度496bp.内参照β－actin引物上游序列5ˊ-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3ˊ，下游序列5ˊ-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3扩增长度250bp.反应体系如下：引物TSP-110×bufferdNTPTaq酶DEPC水1.OμL2.5μL0.5μL0.3μL17.7μLcDNA3.025.0μLμL反应参数如下：95℃预变性5min,95℃变性45s,55℃退火45s，72℃延伸60s，总共33个循环，72℃继续延伸10min。取5μL扩增产物和1μL上样缓冲液混匀后用加样枪点至1.5﹪琼脂糖凝胶加样孔中进行电泳，同时选取靠左侧加样孔加入DNAMarker3μL比较PCR扩增产物的目的基因片段的长度，同时以ddH2O代替扩增产物作为阴性对照。电泳凝胶在紫外灯下观察并照相，用计算机图象处理系统处理以吸光度代表表达量，计算相对相对表达量。3.统计学分析所有计量资料以均数±标准差(X±s)表示，用spssl1．0统计软件进行统计分析，NO含量采用组间单因素方差分析，其余变量采用两独立样本变量的t检验，方差不齐组采用t'检验。9 华中科技大学硕士学位论文结果㈠组织学改变Sham组在整个实验过程中肾小管及间质结构正常，未见明显病变。UUO组大鼠肾组织于造模后第3天后开始出现肾小管扩张、肾小管上皮细胞脱落和坏死，第7天肾间质扩张、伴单个核白细胞浸润；第14天出现较明显肾小管损害和肾间质纤维化，部分小管细胞基底膜不同程度断裂、增厚。与对UUO相比，RSG组肾小管损害和肾间质纤维化程度均明显减轻。（p<0.05）见表1Table1.Therenalinterstitialfibrosisscoreineachgroupatthreetimepoints(x±s)groupshamUUORSG3d00.85±0.10#*0.30±0.03*7d01.51±0.26#*0.64±0.08*14d01.91±0.35#*1.06±0.14*Versusshamgroup，﹡p＜0.05；versusUUOgroup，﹟p＜0.05㈡肾组织NO的含量各时间点sham组NO水平相对稳定。造模后第3天UUO组的NO水平与sham组相比，基本没有变化，在第7天时有所增高，为sham组的2.3倍（p＜0.05），而造模后各时间点RSG组NO的水平均高于sham组和UUO组（p＜0.05）并随时间的延长逐渐增高，在第3、7天分别是sham组的2.1倍，3.3倍，至第14天时为sham组的4.3倍。与UUO组相比较，RSG治疗组NO水平在第3天明显升高，至第7天达1.3倍，而在第14天仍显著高于UUO组。（p＜0.05）见表2Table2.ThelevelofNOinthekidneyineachgroupatthreetimepoints(µmol/mgprot)(x±s)组别ShamUUORSG3d0.61±0.070.59±0.111.32±0.12﹟﹡7d0.58±0.061.35±0.08﹡1.93±0.24﹟﹡14d0.61±0.121.88±0.25﹡2.61±0.41﹟﹡Versusshamgroup,﹡p＜0.05;versusUUOgroup,﹟p＜0.0510 华中科技大学硕士学位论文㈢肾组织TSP-1mRNA及其蛋白半定量分析免疫组化显示正常肾组织几乎无TSP-1的表达，而无论UUO组还是RSG组均可见小管间质TSP-1的表达。造模后第3天UUO组梗阻侧肾组织的近端小管即可见表达，第7天显著升高，此时在间质和肾小球也可见少量的表达，但主要集中在肾小管上皮细胞；第14天呈现下降的趋势。与之对应的mRNA的表达在各时间点呈现相同的变化过程。RSG组在第3天也可见TSP-1在肾小管少量表达，同样在第7天时增加，在以后的第14天呈现逐渐下降趋势。与UUO组比较，二者皆显著降低。(p＜0.05）见表3、表4.Table3.Semi-quantitativeanalysisofThrombospondin-1mRNAexpressioninthekidneyineachgroupatthreetimepoints(x±s)groupShamUUORSG3d00.52±0.13﹡﹟0.12±0.06﹡7d01.34±0.23﹡﹟0.50±0.11﹡14d01.09±0.14﹡#0.46±0.07﹡Versusshamgroup,﹡p＜0.05;versusUUOgroup,﹟p＜0.05Table4.kidneySemi-quantitativeanalysisofThrombospondin-1proteinexpressionintheineachgroupatthreetimepoints(x±s)groupshamUUORSG3d01.56±0.31#*1.05±0.12*7d04.48±1.10#*2.45±0.78*14d01.50±0.17#*0.89±0.10*Versusshamgroup，﹡p＜0.05；versusUUOgroup，﹟p＜0.0511 华中科技大学硕士学位论文讨论梗阻性肾病多是由于机械性因素引起尿液引流不畅或排出障碍，导致肾脏结构和功能的损害，在临床上多见于老年人前列腺增生肥大和尿路结石的病人，部分患者梗阻解除后肾功能呈进行性恶化，肾活检研究发现部分患者的肾脏主要病理特征为肾小管的萎缩和肾间质进行性纤维化，同时研究表明肾功能的下降与肾间质纤维化的程度有密切的关系（3）。UUO模型是目前研究肾小管间质纤维化较为成熟的一种动物模型，结扎大鼠输尿管后随着疾病的进展，肾间质纤维化病变突出，最终导致整个肾脏弥漫性损害。在本实验中我们借助UUO模型同样观察到UUO组大鼠梗阻侧肾组织的上述病理改变。慢性肾间质纤维化的发生涉及多种机制和多种因素的共同参与。肾脏梗阻后随着炎症细胞的浸润，大量合成与分泌炎症介质和细胞生长因子，这些炎症介质和细胞生长因子最终共同通过转化生长因子β（TGF-β）促进系膜细胞和间质成纤维细胞分泌大量的细胞外基质（ECM）,从而导致肾小球硬化和肾间质纤维化。但是作为致纤维化最终决定因子的TGF-β在肾脏局部以无活性的LAP--TGF-β复合物的形式被分泌出来，研究表明TSP-1是TGF-β的主要内源性激活剂，TSP-1能够使该复合物中的LAP结构发生改变，从而使TGF-β转变为活性形式而发挥其生物学功能（17）。研究表明NO可以调节TSP-1的表达，给予高糖培养的系膜细胞NO可使已增加的TSP-1mRNA及其蛋白质恢复到基础水平;同样给予ODQ(一种可溶性鸟苷环化酶抑制剂)或Rp-8-pCPT-cGMPS(一种依赖CGMP蛋白激酶抑制剂)则可阻断高糖所致的系膜细胞TSP-1表达的增强效应,另外给予一氧化氮合成酶辅助因子四氢叶酸(BH4)同样可以抑制高糖对TSP-1表达的增强（8）。研究发现激活PPARλ可以促进内皮细胞释放NO。罗格列酮是人工合成的PPARλ配体，当前研究认为罗格列酮不但可以改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗，而且还能够减少糖尿病肾病患者的蛋白尿，延缓肾小球硬化的进展，体外实验也表明罗格列酮能够抑制高糖环境中培养的系膜细胞分泌胶原Ⅲ（4-6，15），表明罗格列酮能够防止肾脏纤维化的发展；但当前实验多从罗格列酮对直接致纤维化的12 华中科技大学硕士学位论文生长因子如TGF-β、CTGF及α-SMA的表达进行研究（3，6，16），对TSP-1的表达是否有影响还不清楚，因此本实验拟观察罗格列酮是否能够促进NO的释放，下调TSP-1的表达，从而减少肾脏局部TGF-β的激活，进一步探讨罗格列酮防止肾间质纤维化的作用机理。血小板反应蛋白1（TSP-1）是一种分泌型同源三聚体糖蛋白，最初从血小板α颗粒和伤口渗出液中分离出来的，主要存在于细胞外基质中，参与组织的修复和血管凋亡等多种细胞学效应（18）。既往研究证明，无论体内或体外，TSP-1能够使LAP-TGF－β复合物中LAP构型发生改变，从而激活TGF-β，发挥其致纤维化的作用（19.20）。TSP-1对TGF-β的的激活涉及多个序列的参与，TSP-1Ι型重复结构中的KRFK序列和LAP的LSKL序列相结合，使LAP构象发生改变，从而与TGF-β活性部分解离，最终使TGF-β获得生物学活性(21.22)。因TGF-β除具有导致器官纤维化等不良作用外，还具有对机体有利的一面，它可以抑制自身免疫性炎症反应和肿瘤细胞的生长，长期抑制TGF-β的表达会造成严重的副作用（23.24）。因此调节TSP-1可能更有利于治疗肾间质纤维化，研究表明TSP-1对生理水平的TGF-β活性无影响（8），但可以激活病理条件下产生的TGF-β，因此探讨病理条件下对TSP-1表达的调节可能比干预TGF-β更有治疗价值。在本实验中通过免疫组织化学染色方法观察到UUO组大鼠梗阻侧肾组织在第3天时表达增强，阳性染色主要位于近端小管，第7天时显著升高，第14天呈现下降趋势，同UUO组比较，RSG组TSP-1的表达呈现相同的变化趋势，但TSP-1的表达强度明显减弱（p<0.05），而且发现TSP-1表达越强肾间质纤维化的程度越重。上述结果表明罗格列酮能够抑制TSP-1的表达，减轻肾间质的纤维化。生理状态下，NO主要由血管内皮细胞在内皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)作用下利用L-精氨酸合成，除了可以改变肾脏血流动力学,防治血小板粘附集聚，白细胞的黏附及血栓形成，而且还具有抗凋亡，抑制细胞外基质的合成，防止脏器纤维化作用（25-30)。Wang利用高糖环境中培养的系膜细胞研究证明NO通过NO-cGMP-PKG途径减少TSP-1的生成（8）。Polikandriotid研究发现PPARλ天然配体15d-PGJ2和环格列酮和罗格列酮与PPAR-λ结合后能够促进脐静脉内皮细胞释放NO并提高NO的利用率（7）组大鼠在整个实验过程中梗阻侧肾组织NO含量均明显高于UUO组（p<0.05），而其随着13。本研究发现RSG 华中科技大学硕士学位论文时间的延长NO的含量逐渐升高，提示罗格列酮可以促进肾脏局部NO的释放。研究还发现UUO组大鼠NO水平同sham组比较在梗阻后第3天无显著差异，而RSG组NO水平分别是sham组和UUO组的2.1倍和2.2倍。表明此时可能因为尿路梗阻早期应激导致缩血管效应较强，肾脏代偿合成NO受到损害，导致肾组织缺血，而罗格列酮能够抑制缩血管物质的作用，维持了正常肾脏内皮功能，促进了eNOS释放NO。在第7天、第14天，RSG组肾组织NO水平仍然增加，表明罗格列酮较好的保护了血管内皮的功能，促进了NO的释放。血管内皮产生的NO弥散到周围组织，被小管上皮细胞和间质成纤维摄取后抑制TSP-1的表达，从而减少了TGF-β复合物的激活；同时我们也观察到UUO组大鼠肾组织在整个实验过程中NO的含量同样增加，但是肾脏炎症细胞浸润和间质病变明显重于RSG组，这可能因为梗阻后诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）合成增加，局部释放高浓度的NO，活化促炎症细胞因子的合成和释放，趋化更多的炎症细胞浸润，加重组织的损伤。尽管此时NO合成虽有所增加，但并不能下调TSP-1的表达,这可能因为各种炎症因子和生长因子拮抗NO的生物学效应，促进了TSP-1的表达，同时梗阻早期存在的氧化应激产生的活性氧对NO的消耗及其氧化产物对内皮细胞的损伤作用，这一点正好同Franzier的人的观点相符（31-33）。因此我们认为罗格列酮促进梗阻性肾病早期NO的释放，一方面抑制各种炎症因子减轻炎症反应，另一方面通过促进肾脏局部NO的释放，抑制了TSP-1的表达从而间接抑制了肾脏局部胶原蛋白的沉积。减轻了肾间质纤维化。综上所述，在梗阻性肾病早期，罗格列酮可能通过维持并促进肾脏局部NO的释放，下调TSP-1的表达来防止肾间质纤维化的。14 华中科技大学硕士学位论文附图32.521.510.50附图1各组大鼠梗阻侧肾组织纤维化半定量评分分值UUO组RSG组3d7d14d与UUO比较P<0.05,与RSG组比较P<0.053.532.521.5附图2各组大鼠梗阻侧肾组织各时间点NO水平sham组UUO组RSG组10.50与UUO比较P<0.05,与RSG组比较P<0.05第3天sham组与与UUO比较无显著性差异。第7天、第14天与UUO组比较P<0.05,与RSG组比较P<0.05153d7d14d 华中科技大学硕士学位论文1.81.61.41.210.80.60.40.20附图3各组大鼠梗阻侧肾组织mRNA半定量分值UUORSG3d7d14d与UUO比较P<0.05,与RSG组比较P<0.056543210附图4各组大鼠梗阻侧肾组织TSP-1表达半定量评分分值UUO组RSG组3d7d14d与UUO比较P<0.05,与RSG组比较P<0.0516 华中科技大学硕士学位论文ABA图：第7天UUO组可见部分肾小管扩张，肾间质水、肿增宽，其间大量炎症细胞浸润B图：第7天RSG组亦可见部分肾小管扩张，但肾间质水肿和炎症细胞浸润程度均较UUO组减轻。（HE×200）CDC图：第7天可见UUO组肾小管及间质大量的棕黄的颗粒，即TSP-1的表达主要集中在肾小管上皮细胞；D图：第7天RSG组TSP-1表达主要位于肾小管上皮细胞，与UUO组比较，棕黄色颗粒显著减少。（免疫组化×100）Mabc500bp496bpΒ-actin250bp各时间点TSP-1mRNA的表达水平左起第一列为Marker，图中a、b、c分别代表第3天第7天第14天mRNA水平，各组条带左起三条依次为sham组、UUO组、RSG组。从上图可见UUO组TSP-1在第7天表达最强，在第3天和第14天均较第7天低。Sham组未见TSP-1mRNA表达，个时间点RSG组TSP-1mRNA表达弱于UUO组17 华中科技大学硕士学位论文参考文献[1][2][3][4][5][6][7][8]BeckerGJ，HewitsonTD．Theroleoftubulointerstitialinjuryinchronicrenalfailure．CurrOpinNephrolHypertens，2000，9:133-138．王海燕重视和研究小管间质损害在肾小球疾病发展和预后中的作用．中华肾脏病杂志，2000，16：5-6．YangN，IsbelNM,Nikolie-PatersonDJ,etaI.Localmacrophageproliferationinhumanglomerulonephfitis．Kidneylnt,1998，54：l43-151TsuchiyaT，ShimizuH,ShimomumK,etal.TroglitazoneinhibitsIsolatedcellproliferation，andinducesapoptosisinisolatedratmesangialcells．AmJNephrol，2003，23：222-281．刘章锁，牛红心，程根阳，等．罗格列酮对DM大鼠肾保护机制的研究．中华肾脏病杂志，2004，15：35-39．林沁，马骥，顾勇，等．罗格列酮对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的保护作用及其机制．中国临床药学杂志，2003，12：135-138．CalnekDS,MazzellaL,RoserS,etal.Peroxisomepro-liferator-activatedreceptorligandsincreasereleaseofnitricoxidefromendothelialcells.ArteriosclerThrombVascBiol,2003,23:52-57.WangS,ShivaS,PoczatekMH,etal.NitricoxideandcGMP-dependentproteinkinaseregulationofglucose-mediatedthrombospondin1-dependenttransforminggrowthfactor-ßactivationinmesangialcells.JBiolChem,2002,277:9880–9888.[9]Schultz-CherryS,LawlerJ,Murphy-UllrichJE.Thetype1repeatsofthrombospondin1activatelatenttransforminggrowthfactor-beta.JBiolChem,1994,269:26783-26788.[10]CrawfordSE,StellmachV,Murphy-UllrichJE,etal.Thrombospondin-1ismajor18 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华中科技大学硕士学位论文血小板反应蛋白1在肾间质纤维化中的作用脏器纤维化是各种脏器因缺血、缺氧或损伤后产生的生理性代偿反应，过度代偿将会合成大量胶原，损伤器官的正常功能，导致脏器功能衰竭（1）。肾脏慢性损伤后往往表现为肾间质胶原蛋白的沉积即肾小管间质纤维化（TIF），TIF是各种慢性肾病发展致终末期肾病的主要病理特征之一，肾功能进展缓急与肾小管间质纤维化的程度密切相关（2）。肾小管间质纤维化的发生机制相当复杂，参与肾小管损伤和间质纤维化的机制包括各种细胞因子的促生长作用和大量炎症细胞的浸润，以及炎症细胞分泌的各种炎症介质（3）。此外肾小球毛细血管袢和肾小管周围毛细血管网的进行丢失也参与了肾脏进行性纤维化的发生（4）。大量研究表明上述各种因素最终通过上调肾脏局部转化生长因子β（TGF-β）的表达促进了肾小球的硬化和肾小管间质的纤维化。然而，机体各种脏器包括肾脏在内局部分泌的TGF-β最初以无活性的复合物--潜在相关肽LAP(latency-associatedpeptide)-TGF-β形式存在。TGF-β在该复合物中不能发挥其生物学活性，必须经一系列的生物转化作用后才能转变成有活性的TGF-β发挥其生理和病理作用。研究表明在各种炎症性肾脏疾病中血小板反应蛋白1（Thrombospondin-1,TSP-1）是TGF-β的主要内源性激活剂（5），在调节肾脏纤维化过程中发挥着重要的作用。因此有必要了解TSP-1的生物学特征及其在调节器官纤维化中的作用机制，为防治肾脏纤维化提供理论依据。一、TSP-1的概述1.TSP-1的分子结构、分布及其主要生物学功能1.1TSP-1的分子结构TSP-1又称凝血酶敏感蛋白-1(thrombin-sensitiveprotein-1),是一种同源三聚体糖蛋白，单体亚基分子量为180kD。目前已发现的TSP家族成员包括TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4以及TSP-5。其中对TSP-1研究的最多，其生物学特性了解的也最为详细和清楚。TSP-1的分子结构包含六个主要功能区：1个N-末端肝素结合区，1个由分子内二硫键连接的前胶原样结构域，3个裂解素样Ι型重复序列，3个表皮生长因子样（EGF-like）Ⅱ型重复序列，1个Ca离子敏感的Ⅲ型重复序列和1个C-末端球型结构域22 华中科技大学硕士学位论文（5）1.2在体内的分布TSP-1在体内有两种存在形式：可溶性的分泌型和不溶性的基质型。可溶性的分泌型主要存在于血液中，不溶性的基质型主要存在于细胞外基质中（6）。血小板α颗粒（7）管平滑肌细胞，成纤维细胞等均可产生TSP-1（8）。机体损伤发生炎症或伤口愈合时，可以见到TSP-1在损伤或炎症部位的表达显著增加（9）细血管内皮细胞、平滑肌细胞以及系膜细胞有极少量的表达外，其余部位均无TSP-1表达。但是当肾组织受到严重损伤时，则可见TSP-1在肾小管上皮细胞及间质中大量表达（5）。研究证明，新月体型肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、糖尿病肾病等动物模型在其发病及整个病理过程中均发现TSP-1在肾小管和肾间质的表达，而且和肾间质纤维化的程度呈明显的正相关（5、10、11）。1.3TSP-1的分子生物学功能TSP-1特定的分子结构决定了其特殊的分子生物学功能。体外研究表明TSP-1可以调节血小板的聚集、血管生成、细胞增殖、黏附、迁移以及激活TGF-β1（5）。TSP-1的上述功能与其分子结构中的功能区有关，其中N-末端结构域的肝素结合区段可以使血小板发生聚集、促使内皮细胞增殖和移行；TSP-1的Ⅰ重复序列的三个备解素样重复序列,含有硫酸肝素结合位点,可结合TGF-β1等多种蛋白生长因子,参与抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡和抑制血管的新生等。目前对TSP-1结构与功能研究的重点集中也多集中在此段;TSP-1的Ⅲ型重复序列是与钙离子结合的主要区域;C末端结构域则参与TSP-1对内皮细胞移行和血小板聚集的调节（12-14）段结构域功能的研究现在还知之甚少，有待进一步研究阐明。研究发现可溶性的TSP-1能够拮抗细胞间的黏附的作用以及触发肌动蛋白细胞骨架的重构。而不溶性的TSP-1则能够支持细胞之间的黏附（6）。除此之外,TSP-1的一个重要特征就是激活非活性的TGF-β从而导致器官的纤维化，但对基础水平的TGF-β1的活性无显著影响（15）。另外TSP-1可以明显诱导血管内皮细胞的凋亡，研究表明在肿瘤发生中，肿瘤毛细血管增生伴随着TSP-1表达显著减弱，而促进血管生成的血管生成因子（VEGF）表达增加。体外细胞培养表明TSP-1可以促进肿瘤血管内皮细胞的凋亡，抑制血管内皮细胞生成，23。中含有大量的TSP-1，细胞外基质中的TSP-1除来源于血小板外,体内多种细胞如血。在正常肾组织中,除肾小球毛。除此之外，对于其余区 华中科技大学硕士学位论文延缓肿瘤的生长，因此推测促进肿瘤组织TSP-1的表达可以抑制肿瘤血管生成，加速肿瘤细胞的凋亡（16-18）。而在肾脏疾病中情况同肿瘤中恰恰相反，肾脏局部表达的TSP-1促使肾脏血管内皮凋亡，促使肾脏血管损毁，加剧肾脏缺血缺氧，加速脏间质纤维化的发生发展。二、影响TSP-1在体内表达调节的因素TSP-1在体内的表达受到各种因素的调控，研究表明高浓度的葡萄糖、氨基酸和缺氧等都可影响TSP-1的表达(19)。Poczatek研究发现体外高糖(30mM)培养的系膜细胞TSP-1的表达增加（20）。同样在高糖环境下培养血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞，TSP-1表达均明显增加（19）。在糖尿病Zucke大鼠的颈动脉及冠状动脉管壁的内皮细胞亦可见TSP-1表达显著增加。临床研究结果提示同正常人比较，糖尿病病人尿液中TSP-1含量明显升高（21）。因此，血糖升高可能参与了对TSP-1表达的调节，但具体调节方式还不清楚。另外发现向体外培养的血管平滑肌细胞培养基中添加血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），血管平滑肌细胞TSP-1的表达增加。但是AngⅡ并非直接刺激血管平滑肌细胞表达TSP-1，需要血小板衍生生长因（PDGF）的参与，AngⅡ能够刺激PDGF的产生，间接诱导TSP-1的表达。在高糖环境里，尤其在糖尿病患者中，往往同时存在高血糖和血浆AngⅡ浓度的增加，因此二者协同作用共同促进了肾脏组织TSP-1的表达从而促进了肾脏局部大量TGF-β的激活，加速了肾脏的硬化过程。Meek等发现,用高氨基酸培养基培养大鼠肾脏系膜细胞时,TSP-1表达较用高糖培养基培养增强,DNA合成增强,联用培养时合成更强（21）。低氧可诱导人与小牛血管内皮细胞TSP-1表达,氧分压低于30torr/h,1h后,可致TSP-1基因转录明显增强,72h后TSP-1蛋白水平增加;低氧致稳定水平TSP-1转录及蛋白质生成由精氨酸丁酸盐启动，此外PDGF、成纤维细胞生长因子(EGF)、TGF-β等都可以诱导TSP-1的表达（22）。此外研究发现NO是TSP-1的负调节因子，NO浓度升高可以抑制TSP-1的表达。Wang等给予高糖培养的系膜细胞NO可使已增加的TSP-1mRNA及其蛋白质恢复到基本水平;同样给予ODQ(一种可溶性鸟苷环化酶抑制剂)或Rp-8-pCPT-cGMPS(一种依赖CGMP蛋白激酶抑制剂)则可阻断高糖所致的系膜细胞TSP-1表达的增强效应,另外给予一氧化氮合成酶辅助因子四氢叶酸(BH4)同样可以抑制高糖对TSP-1表达的增强。因此Wang认为高糖可能是通过降低一氧化氮(NO)合成或下调NO-cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)信号实现的（15）。24 华中科技大学硕士学位论文三、TSP-1参与调节肾脏纤维化身体各器官、系统发生损害时会伴随纤维蛋白的形成，这是机体正常的生理代偿反应，随着损伤的修复，纤维蛋白逐渐降解，组织器官功能得到恢复，但是过度代偿将导致大量胶原蛋白的沉积，影响器官的生理功能。研究证实器官的各种纤维化疾病都和TGF-β有密切的关系。肾脏纤维化包括肾小球的硬化和肾小管间质的纤维化，现在研究较清楚的导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化的分子基础主要是肾脏受到病理损伤或自身免疫反应产生的大量TGF-β,TGF-β促进系膜细胞和间质成纤维细胞分泌大量纤维蛋白胶原，同时抑制基质金属蛋白酶（MMPs）对胶原蛋白的降解。因此认为TGF-β是一种主要的促纤维化细胞因子。TGF-β是一种影响细胞分化、生长和基因表达的潜在细胞因子。缺乏TGF-β会引起严重的自身炎症反应，发育畸形并且会增加肿瘤发生的风险，延迟伤口的愈合，但是过多的活性TGF-β则会促进肿瘤的发生和多种器官系统的纤维化，抑制免疫系统。研究表明TSP-1是TGF-β的主要内源性激活物之一，在正常肾组织或只是受轻微损伤的肾组织里TSP-1表达很少，而在受到严重损伤的肾小球和肾小管里则大量表达（5）。在人类的各种肾病模型如新月体肾小球肾炎、系膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、高血压肾病、糖尿病肾病等模型中均可发现TSP-1的表达，而且主要在肾小管间质，并且和纤维化的程度相关。在炎症性的肾病模型里，TSP-1是TGF-β的主要内源性激活物，TSP-1的表达在时间上和空间上都和TGF-β的增加有关，因此认为TSP-1可以作为肾间质纤维化程度的早期预测指标（7）。在人系膜增生性肾小球肾炎模型抗Thy1肾炎里，TGF-β的mRNA和蛋白的含量有所增加，同时发现TSP-1的表达在空间和时间上都在调节着TGF-β。不少研究发现，糖尿病肾病的肾组织里，依赖于TSP-1的TGF-β活化在肾小球硬化中起得主要作用（23）。病理水平的葡萄糖可以刺激TSP-1表达的增加。Poczatek等体外实验研究发现，正常大鼠和人类肾系膜细胞在高糖环境条件下培养，会产生更多的TGF-β，而加入GGSWHW或LSKL肽段来拮抗TSP-1的作用，能够显著减少活性TGF-β的分泌，减少肾小球基质蛋白的积累(20)。但并不影响基础水平的TGF-β1活性。除了TSP-1外，还存在其他激活物可刺激非活性TGF-β的活化。有人比较了敲除TSP-1和TGF-β基因的小鼠是否表现一致时发现，敲除TSP-1基因的小鼠表现为TGF-25 华中科技大学硕士学位论文β表达减弱，而敲除TGF-β基因的小鼠表现为TGF-β完全缺乏-严重过度的自身免疫反应（23），还有人发现只有一条TGF-β等1位基因的小鼠会增加细胞的变性和肝肾肿瘤的发生的易感性。但是在敲除TSP-1基因的小鼠不会增加肿瘤发生的易感性。所以如果直接阻断TGF-β受体-配体相互作用的方法来治疗肾间质纤维化会有很多的副作用，相反，如果针对TSP-1介导的TGF活化来进行干预，可能在治疗纤维化中有较好的前景。四、TSP-1在肾间质纤维化中的作用机制TGF-β在各种组织中以无活性复合物的形式存在，需要在细胞外激活后才能和它的受体结合后发挥作用，这种非活性的TGF-β复合物由成熟肽段TGF-β和LAP及LTBP（非活性TGF-β结合蛋白）共价结合组成（7）。LAP和TGF-β成熟肽段的结合能够避免TGF-β和它的受体结合及信号传导（5）。因此，大多诱导前体复合物活化的过程，不是降解LAP就是改变LAP和TGF-β成熟肽段的相互作用。在体外，PH的改变、γ射线、去垢剂、加热、蛋白酶水解等都能激活非活性TGF-β(7)。在体内，调控非活性TGFβ活性的生理机制至今尚未完全清楚。血纤维蛋白溶酶，组织蛋白酶等还有其他一些酶都能活化非活性TGF-β，体内应激反应产生的氧自由基也能调控非活性TGF-β的激活(25)。最近还发现非活性TGF-β能和整合素αvβ6通过在TGF-β复合物LAP里的RGD序列相结合导致非活性TGF-β的激活(2)。另一种非活性激活的重要机制是直接和非活性复合物作用使非活性TGF-β活化。在各种炎症性肾病包括糖尿病和高血压性肾病里TSP-1是TGF-的主要内源性激活物之一，介导TGF-β激活的机制在各种组织器官中都广泛存在（7）子中就有1个TSP-1从血小板α颗粒里释放出来后就带有活性的TGF-β，TSP-1和有活性的TGF-β一起在释放的血小板里组成复杂的复合物。有人发现外源性的TSP-1将与其相关的活性TGF-β耗尽后，能使非活性的TGF-β转变成有活性的TGF-β。体内存在有活性的LAP-TGF-β-TSP-1成熟肽段三聚体复合物，而TGF-β生物活性的维持，则需要有TSP-LAP的存在（26）。LTBP的抗体不能干预TSP-1激活非活性TGF-β，因此LTBP依赖TSP-1的TGF-β激活过程中不起作用。各种蛋白酶的抑制物不能阻断TGF-β被TSP-1活化的过程，因此TGF-β和TSP-1的结合能足够诱导活化，而不需要蛋白酶的参与（27）。有人报告，TSP-126。有人发现500个TSP-1分 华中科技大学硕士学位论文里的3个裂解素样Ι型重复序列有非活性TGF-β复合物在TSP-1上的结合位点。RFK（含有3个氨基酸的序列：R-精氨酸F-苯丙氨酸K-赖氨酸）定位在第1个和第2个Ι型重复序列之间（28）。RFK序列和LAP结合能够竞争性的抑制TSP-1和非活性TGF-β复合物形成。非活性TGF-β的激活主要是靠TSP-1，而TSP-2等异构体缺少RFK序列，因此不能激活非活性的TGF-β。TSP-2和TSP-1分子的RFK相对应的肽段是RIR（R-精氨酸，I-亮氨酸），但RIR不能像RFK那样和LAP结合并激活TGF-β（29）。TSP-2能和非活性TGF-β的成熟肽段结合，竞争性地抑制TSP-1的激活，所以推断TSP-2能通过WxxW组件（W-色氨酸）和非活性TGF-β结合，但是并不能激活它，因为TSP-2缺少RFK序列。Kyriakides等发现，敲除TSP-2基因的小鼠在伤口愈合过程中的表现类似TGF-β活性增加的表现，因此推测在TSP-2缺陷的动物里，由于这种TSP异构体反作用的消失，TGF-β活性增加，但这个观点仍需进一步证实。另一个非活性TGF-β复合物在TSP-1上的结合位点相关序列是WxxW，它存在于每个Ι型重复序列中，这个序列与非活性TGF-β成熟肽段中的某个位点结合，并促进RFK激活非活性TGF-β子上的RFK的互补位点（28）。WxxW肽段不能单独激活非活性TGF-β，包含WxxW序列的肽段能用于竞争性抑制TSP-1激活非活性TGF-β，而成熟TGF-β上和WxxW结合的位点仍在探索中。上图显示在肾脏疾病中TSP-1是TGF-Β的主要激活剂。各种损伤因素诱导肾脏细胞产生和分泌细胞介导TSP-1在疾病早期的应答。在细胞外TSP-1激活TGF-Β依赖于细胞周围环境。TGF-Β作为一种27 华中科技大学硕士学位论文主要的促纤维化因子进一步加重肾脏损伤，导致肾脏疾病进展。LAP的N-末端抗体可以阻断非活性TGF-β的活化过程，TSP-1上的RFK序列在TSP-1和LAP的相互作用中很重要。那么LAP上和RFK互补的序列就同样很重要，而这个序列就是L54SKL57,就是TSP-1在非活性TGF-β复合物里的LAP上的结合位点，包含LSKL序列的肽段能阻断TSP和LAP的相互作用。有数据表明TSP通过LSKL和RFK序列还可以激活非活性TGF-β2(5)。4.2TSP-1抑制血管生成，加速血管内皮细胞凋亡研究表明慢性肾脏疾病往往存在肾小管周围毛细血管网的丢失，且毛细管网损毁越严重，肾脏纤维化的程度也越严重，提示因毛细血管网的丢失而导致的肾脏缺血参与了肾脏纤维化形成的发展。参与肾脏毛细血管内皮生成和凋亡的主要因子是内皮生长因子（VEGF）和TSP-1，TSP-1表达增加或VEGF表达下调或二者共同导致肾小管周围毛细血管网的损毁。TSP-1通过与毛细血管内皮细胞上的CD36结合来抑制内皮细胞的增殖、黏附、移行及毛细血管的形成，从而抑制血管生成。Kanda等（29）发现，TSP-1能抑制FGF诱导的大鼠肺毛细血管内皮细胞增殖。血管的生成首先是毛细血管内皮细胞增殖形成毛细管束，而毛细管束的形成受TSP1的调节（30）。TSP1通过P38激酶的细胞内信号途径，经由TSP-1／CD36调节导致半胱氨酸蛋白水解酶Caspase-3活性增加，促进内皮细胞凋亡，进而抑制血管生成。TSP-1I型重复区中包含两个独立的抑制新生血管的子域，它们通过抑FGF-2和血管内皮生长因子(VEGF)等促血管生成因子的表达，从而抑制血管生成。TSP-1可抑制一氧化氮(NO)对内皮细胞的作用。缺氧环境下，内皮细胞通过NG一硝基一L一精氨酸甲酯(L—NAME)诱导TSP-1表达而抑制NO的生成、释放，引起一系列的病理生理改变。通过TSP1的I型重复区和CD36受体下调cGMP和cGMP相关的蛋白激酶途径，TSP1能明显抑制NO诱导的内皮细胞的趋化、黏附和增殖（31）。TSP-1可以诱导内皮细胞凋亡。Nor等证实，在TSP一1诱导的内皮细胞凋亡反应中，CD36、p59fyn、Caspase-3和P38分裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)是关键的信号分子。TSP-1／CD36复合物可激活p59fyn相邻的P38MAPK，从而启动凋亡途径。Schultz-Cherry等证实，血小板a颗粒中释放出的TSP-1和TGF-β复合物能抑制内皮细胞生长。28 华中科技大学硕士学位论文VEGF是一组分子量为34-45Kd的同源二聚体糖蛋白，研究发现至少存在5种异构体，其中VEGF165是主要的异构体（32）。生理状态下，体内很多组织能检测到VEGF的存在，如肺泡细胞、肾小球及近端肾小管肝细胞脑细胞等，其中以肺肾含量为最高（33）。VEGF是一种特异性的作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，是血管形成过程中起核心作用的因子，具有诱导内皮细胞的分化，和转移抑制内皮细胞凋亡增加微血管通透性的作用（34）。VEGF的表达受多种因素的调控，缺氧被认为是迄今所发现的最强的调节因素，其具体机制可能是低氧诱导因子-1生成从而促进VEGF的转录。人类所有类型的细胞都能在低氧的诱导下表达VEGF，低氧和原癌基因的信号转导能够在肿瘤微血管系统里抑制TSPI的表达和诱导VEGF的表达。很多细胞因子如表皮细胞因子（EGF）、肿瘤坏死因子(TNF)、AngⅡ等以及高糖，都能刺激VEGF的表达（35、36）。终末期肾病主要是以进行性肾小球硬化和肾间质纤维化为特征的。有人发现，大鼠5/6肾切除模型体内，肾脏毛细血管的减少肾小球的硬化肾间质的纤维化都和TSP-1的表达增加及VEGF的表达减弱有关。VEGF的表达减少可以反映肾脏血管生成的减弱，从而导致肾脏瘢痕的进展和肾间质纤维化。肾血管生成减少会增加抗血管生成因子如TSP-1的产生，TSP-1能拮抗VEGF的作用，并能抑制bEGF和VEGF介导的内皮细胞的增值，诱导内皮细胞的凋亡。同时，TSP-1的表达能激活非活性TGF，导致肾间质纤维化的进展（37）。VEGF与TSP-1mRNA相对表达量之间呈线性负相关，这表明VEGF表达的下调也是肾间质纤维化潜在的机制。Juan等发现，TSP-1表达的消失会导致相应的VEGF和它的受体VEGFR2的表达的增加以及活性基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平的增加，在基质的降解中起重要作用(38)。VEGF在肾脏纤维化中的作用具有两重性。一方面肾小球足细胞及肾小管上皮细胞VEGF的表达减少是肾毛细血管减少，肾小管及肾间质氧供减少，导致肾脏纤维化。另一方面，VEGF的微血管渗透作用，能增加肾小球对蛋白的率过滤，增加平滑肌细胞增生及血管壁增厚，或促进系膜细胞合成细胞外基质，从而促进肾小球硬化。五总结总之，上述研究表明在各种实验模型中TSP-1是主要的内源性TGF-β激活因子，诱导多种器官尤其是肾脏的纤维化。TSP-1一方面促进TGF-β的活化，另一方面抑制29 华中科技大学硕士学位论文血管新生，加速血管内皮细胞的凋亡。在各种肾脏病的进展中TSP-1通过上述两种机制导致肾脏纤维化。鉴于TSP--1对基础状态的TGF-β没有影响，所以应研究如何预防病理状态下TSP-1的表达从而减少TGF-β的过量激活，为进一步防止肾间质纤维化开拓更广阔的前景。30 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