日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用

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1、日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用紧鬻嚣鬻逐辛十岩章大学研究生学位论文日本乙型脑炎实验室诊断方法论文题目的研究和应用研究生姓名：孙圣福导师姓名：豢勰警茔专业：预防兽医学研究方向：动物传染病论文报告申请学位级提交日期：2004年5月别硕士中国武汉――望奎圣型墅丝壅竺皇堡堑查垄竺竺壅塑些旦一．摘要日本乙型脑炎JapaneseJapaneseencephalitisvirus，JEV引起的人畜共患的病毒性传染病。主要引起人的神经系统疾病以及猪的繁殖障碍，对养殖业和人类的健康有极大的威胁。猪是本病的扩散宿主，乙脑可以通过蚊虫传染到人类。因此乙脑的诊断和防治不但对

2、于猪的规模化养殖有重要的意义，而且有重要的公共卫生学意义。本课题主要是乙脑实验室诊断方法的研究和初步应用。主要工作包括以下三个方面：1．乙脑全病毒酶联免疫吸附试验诊断ELISA方法的优化及试剂盒的研制与初步应用选取9-11日龄的健康鸡胚增殖乙脑病毒SAl4．14．2株，经过病毒纯化，提纯的病毒包被ELISA板，选择最佳包被条件，确定阴阳性界限值，建立ELISA诊断方法，在4℃和．20℃两种条件进行保存期试验，实验结果表明，酶标板可以在两种条件下保存12个月而不影响检测结果。将该方法的相关试剂装配组成ELISA试剂盒，并对试剂盒进行了特异性、重复性等相关特性进

3、行研究，结果表明ELISA试剂盒特异性强、敏感性高、重复性好。应用该试剂盒与血凝抑制试验HI对85份血清进行同步检测，两者符合率达86．2％。在此基础上，用ELISA试剂盒对127家猪场的1454份血清进行了检测，其中阳性882份，阳性率为60，7％，表明该试剂盒可以在临床上进行血清学的检测和流行病学的调查。2．乙脑病毒逆转录一聚合酶联反应诊断RT-POR方法的建立和初步应用通过对乙脑病毒基因组的比较，针对NSl基因中比较保守的一段序列设计了一对引物，扩增出长度为430bp的片段。提取疑似乙脑病例新鲜病料中的RNA，确定适当的扩增条件，扩增NSl的特异性片段

4、，建立了检测乙脑抗原的PCR诊断方法。并对该方法的灵敏性和特异性进行了研究：用不同滴度的乙脑活疫苗提取RNA进行RT-PCR，产物进行二次扩增，然后进行鉴定，结果表明可以检测到5TCID50的病毒量：检测结果表明，该方法灵敏性高、特异性强。在此基础上对送检的38份病料进行了检测，其中捡出阳性13份，阳性率为39．5％。试验结果表明，RT-PCR方法是临床检测乙脑病原的一种行之有效的方法，特别是对乙脑早期病例的检测。L

5、sA方法的建立和初步应用3．乙脑病毒E基因表达蛋白E日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用E基因是乙脑病毒主要抗原基因。采用E基因的表达产物作

6、为包被抗原，替代全病毒作为包被抗原，可以减少操作人员被感染和应用全病毒ELISA试剂盒造成环境污染的风险。本研究通过大肠杆菌表达乙脑病毒主要抗原基因E基因，选择最佳的表达条件，提取、纯化表达蛋白形成的包涵体，用提纯的包涵体包被ELISA板来检测乙脑抗体，确定最佳的包被条件，确定阴阳性界限值，建立了乙脑E蛋白的ELISA诊断方法。用该方法对引起猪繁殖障碍的其它传染病做了检测，检测结果均为阴性；随机抽取了6份不同抗体水平的血清，用不同批次包被的酶标板进行检测，结果变化不大：用该方法和血凝抑制对97份血清进行同步检测，两者符O％，用该方法和全病毒ELISA方法对合

7、率为958％，比血凝抑制试验阳性率高2送检的97份血清进行了同步检测，两者符合率为95．8％；检测结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。用建立的该方法对送检的892份血清进行了检测，其中阳性血清422份，阳性率达47．3％。以上结果说明该方法可以替代全病毒ELISA方法用于流行病学调查和血清学诊断。R本乙型脑炎；全病毒ELISA；RT-PCR；E蛋白ELISA关键词：旦至圣型堕壅壅墼皇堡堑查鎏墅塑窒翌皇里ABSTRACTaviraldiseaseofhumansJapaneseencephalifis疤isandanimals．causedbymemb

8、eroftheJapaneseencephalitisvirusJZV，aFlaviviridae．JEcausesfamilyillnessesinhumansandleadstoneurologicalistheporcinereproductiveobstacle．Pighost-Humancarlbeinfectedistospreadandbymosquitos．Itimportantdiagnosesofforhumanandanimals’health．ThereforhepreventJapaneseencephalitisfollowing

9、werestudiescarriedout．ofEL